基因表达沉默技术.
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C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞 用逆转录载体或慢病毒载体。
25
6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ ＋ ＋ ＋
－ － － － － ＋ －
具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行
26
b.电穿孔导入：
27
c.病毒感染（以腺病毒为例）：
28
29
第二节 反义核酸技术
30
历史由来
掌握
RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降 解的现象。
小 干 扰 RNA: 具 有 干 扰 功 能 的 这 种短双 链 RNA 就称为小干扰 RNA （ Small interfering RNA,siRNA)。
siRNA 在 ATP 参 与 下 形 成RISC复合体，被RNA 解旋酶解旋成单链，并 由其中的反义链指导移 至 靶 mRNA ， 靶 mRNA 被切割后诱发宿主细胞 针 对 这 些 mRNA 的 降 解 反应。 10
重点
靶
siRNA siRNA实验设计
19 bp duplex
难点
21 nt
2 nt 3 overhangs
oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.
31
基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
32
反义抑制的主要机理
直接作用于靶 mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链 RNA， 从而易被RNA酶H降解。 mRNA 反义 核酸
转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
18
19
20
21
3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl 90°C 4 min 70°C 10 min 室温
22
4) siRNA working?
23
mRNA:Real-time PCR
Biblioteka Baidu11
’
1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
12
13
14
2）利用免费设计软件进行siRNA设计
Invitrogen
Takara Oligoegine
15
软件的选择原则
1、选择可读框内、翻译起始位点之后 50～100nt 的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
5
发现历史
1995年． ． ． ． ． ．
antisense sense
注射
注射
秀丽线虫
6
． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；
而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的
表达。
7
2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
Andrew Z. Fire 安德鲁· 菲尔
Craig C. Mello 克雷格· 梅洛
8
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现 RNAi 也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
9
RNAi 机制
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割成 21nt 左右 、 由 正义 和反义链组成的siRNA
1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了
反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核 酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific
2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇
35
技术难点
提高有效性
a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力
H
deoxyribose
36
第一代硫代修饰（Phosphorothioate）
O
Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways
Protein: Western blot
17siRNA
Mock
24
5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
RNase H
33
反义核酸应用
论著超过１６０００篇。
•基因功能研究（ 1994年流行）
•如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
34
1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
16
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
我用的软件：siDirect
17
3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：
基因表达沉默技术
药学系药物基因组学教研室
2010.06.18
1
教学内容及要求
1 2
RNA干扰 技术 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术
重点
3
4
熟悉
2
参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编 自备材料（个人实践经验）
3
第一节 RNA干扰技术
4
基本概念
25
6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ ＋ ＋ ＋
－ － － － － ＋ －
具体操作步骤： 按照脂质体说明书进行
26
b.电穿孔导入：
27
c.病毒感染（以腺病毒为例）：
28
29
第二节 反义核酸技术
30
历史由来
掌握
RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链 RNA 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降 解的现象。
小 干 扰 RNA: 具 有 干 扰 功 能 的 这 种短双 链 RNA 就称为小干扰 RNA （ Small interfering RNA,siRNA)。
siRNA 在 ATP 参 与 下 形 成RISC复合体，被RNA 解旋酶解旋成单链，并 由其中的反义链指导移 至 靶 mRNA ， 靶 mRNA 被切割后诱发宿主细胞 针 对 这 些 mRNA 的 降 解 反应。 10
重点
靶
siRNA siRNA实验设计
19 bp duplex
难点
21 nt
2 nt 3 overhangs
oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.
31
基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
32
反义抑制的主要机理
直接作用于靶 mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链 RNA， 从而易被RNA酶H降解。 mRNA 反义 核酸
转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
18
19
20
21
3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl 90°C 4 min 70°C 10 min 室温
22
4) siRNA working?
23
mRNA:Real-time PCR
Biblioteka Baidu11
’
1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
12
13
14
2）利用免费设计软件进行siRNA设计
Invitrogen
Takara Oligoegine
15
软件的选择原则
1、选择可读框内、翻译起始位点之后 50～100nt 的序列作为靶序列； 2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
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发现历史
1995年． ． ． ． ． ．
antisense sense
注射
注射
秀丽线虫
6
． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；
而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的
表达。
7
2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
Andrew Z. Fire 安德鲁· 菲尔
Craig C. Mello 克雷格· 梅洛
8
RNAi现象的普遍性
随后陆续发现 RNAi 也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
9
RNAi 机制
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割成 21nt 左右 、 由 正义 和反义链组成的siRNA
1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了
反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。 1984 年，Izant weintraub提出了“反义核 酸技术”的概念。 Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific
2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 ５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇
35
技术难点
提高有效性
a.避免内源性核酸酶对其降解 b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力
H
deoxyribose
36
第一代硫代修饰（Phosphorothioate）
O
Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathways
Protein: Western blot
17siRNA
Mock
24
5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
RNase H
33
反义核酸应用
论著超过１６０００篇。
•基因功能研究（ 1994年流行）
•如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
34
1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基； 7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
16
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
我用的软件：siDirect
17
3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：
基因表达沉默技术
药学系药物基因组学教研室
2010.06.18
1
教学内容及要求
1 2
RNA干扰 技术 反义核酸技术 核酶技术 基因敲除技术
重点
3
4
熟悉
2
参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编 自备材料（个人实践经验）
3
第一节 RNA干扰技术
4
基本概念