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仪器使用VCS原理对WBC进行分类。V是用库尔特原理测量WBC的体积，C是用

23MHz的高频测量的WBC核的体积RF，S是用激光散色光测量的WBC膜的复杂程度。

要达到良好的分类效果，四个因素非常重要：

一、样本回路，特别是样本制备，即WBC膨胀缩小的化学平衡。

二、鞘液回路。

三、光路。

四、电路放大与软件分析。

下面从这四个方面来论述，最后再总结一下与分类有关的重要参数：

一、在样本回路中，试剂、温度等因素会影响样本制备。

试剂的因素中，我们要保证540/350ul的e-lyse和31ul的样本迅速的进入混匀池，进行膨胀的过程。再是200/125ul的s-lyse进入混匀池，使被胀大的白细胞缩回原态。经过这样处理的样本进入flowcell。

在这里需要注意以下几点：

1）、试剂的量要准确，需要用量筒测试。要特别注意的是，在用量筒测量试剂的量是一回事，实际做样本时试剂进入混匀池又是一回事。也就是说F21，F22，F23，F24不能完全模拟做样本时的状态。有时用量筒测量试剂量时是准确的，但在样本进到混匀池前有一部分e-lyse被吸到混匀池中，从而造成了实际e-lyse试剂到达混匀池中偏少，这是由于混匀池通大气的问题，在接下来会讨论。

2）、e-lyse和s-lyse试剂达到混匀池的速度要快，如果sol60或sol63损坏或被改装成单向阀，则有可能会造成速度偏慢，e-lyse与样本接触时间偏长。

3）、e-lyse和s-lyse试剂量的匹配。正常情况下，e-lyse和s-lyse试剂泵是同时打大的量或同时打小的量。当e-lyse或s-lyse试剂泵的中间管子（SOL82控制的管子）被折住时，就会在高温模式下，两个试剂泵打出的量就不匹配。

4）、sol63和sol60的动作要快（F05测试时听声音），电磁阀与泵的动作没有配合好，会造成e-lyse或s-lyse没有完全打进混匀池或者进入混匀池的速度偏慢。

5）、试剂有没有变质，包括剩余的试剂相互混匀，试剂存放的温度不对，国产试剂等等。

6）、混匀池的排空与冲洗。

7）、仪器根据环境温度的变化来选择最佳的分类条件。

1.1、讨论E-Lyse和S-Lyse试剂泵的工作原理。见链接。

1.2、讨论分类试剂进入混匀池的流路。见链接。

1.3、混匀池的工作原理与故障分析。见链接。

1.4、温度对分类的影响。见链接。

二、对鞘液回路进行分析。

鞘液中的“鞘”是剑鞘的“鞘”，其含义是样本被包裹在鞘液中（剑被包裹在剑鞘中）。鞘液的作用是使WBC一个一个通过流动池。

流动池的工作原理与故障分析。见链接。

鞘液回路容易出现的故障：

①、与鞘液相关的八个阀动作不好：VL49（排废），VL55（上鞘液出），VL46A(上鞘液进)，VL41（下鞘液出），VL46B（下鞘液进），VL52（混匀池进），VL44（网织腔进），VL54（鞘液与反冲液的切换）。

②、与VL46A和VL46B并联的管子堵。

③、流动池接头断；流动池底部的接头堵或者脱落。

④、鞘液罐中有细菌滋生，会影响DIFF的本底。鞘液罐的浮子开关问题。

⑤、流动池脏，下鞘液处有赃物。

……

三、光路。

从激光光源到棱镜，到流动池，再到LS Sensor，我们要确保光路的位置正确，激光没有衰减。

要保证光路位置正确，就需要我们调好光路，使S的CV值调在4以下，gain和mean-mode值也在控。

调整光路分两步：

先进行粗调，调出细红线，见链接。

再进行细调，固定好螺丝，见链接。

光路的S的CV值如果偏大，则图形偏胖，细胞群在S轴方向不集中，分类的重复性就会差。S的gain值太大会使分类散点图往右移，会造成EO假性增高。

四、电路放大与软件分析。

分类信号的流程，见链接。

工作站中通过COULTER AccuGate™ analysis 的程序(算法)，对原始数据进行分析。AccuGate analysis 是一种统计分析工具。它采用adaptive contouring methods 与细胞亚群的多方案分析(multiresolution analysis) 来找到各亚群之间的最佳分界线，最终求出WBC的分类百分比。

如果存在异常细胞分布与异常细胞群，AccuGate分析时会产生相应的怀疑性信息。

在Workstation中将WBC总数与百分比相乘，就可以求出各细胞亚群的绝对数。

在Workstation中显示2种类型的散点图：二维与三维。散点图中每种颜色代表不同的细胞亚群，颜色的灰度代表颗粒的密度(浓度)。颜色越暗，颗粒数越少；颜色越亮，颗粒数越多。

COULTER AccuGate™ analysis 的程序(算法)的步骤，见链接。

五、其他的重要参数有：CV，gain，Flowrate，NeDCMn，NeOPMn，NeRLSMn，LS offset，DC count，Noise等等。

5.1、CV中最重要的S的CV，在流动池的调整中，X轴方向对CV的影响比较大。如果S 的CV大，则会使分类的图形在左右方向上变宽，整个图形会变胖，分类的重复性就会变差。 V和C的CV值取决于流路，包括流动池，鞘液流与样本流。流动池内要干净，鞘液压力与样本压力稳定，流路中没有颗粒（如鞘液罐中的细菌会影响其CV值），这样就能保证V和C的CV值。

对于C的CV值，还需要强调TTM模块中地线对其有影响，S的前置放大板与RF BOX 的固定螺丝也会对其有影响。

5.2、V和C的gain调整，需要用大乳胶（P/N：6605419），S的gain调整需要用Latron Control（P/N：7546914）。Latron Control同时来确认V和C的gain。

仪器根据细胞亚群的位置来给出一些诊断提示。如在正常中性粒细胞群的上方有较多的颗粒，就会提示Imm NE1。Gain的调整失当，会造成VCS的mean值会改变，也就是会影响分类散点图中的各个细胞群的位置。从而造成仪器提示的假阳性与假阴性。

5.3、正常情况下，仪器的Flowrate是一个定值，应该为WBC/time=63。如果与鞘液相关的八个阀动作不好，sheath/diff/retic调节阀本身不好等原因都会影响Flowrate。

5.4、NeDCMn，NeOPMn，NeRLSMn是样本的中性亚群的VCS的平均峰值。E-Lyse的量会影响该值。当然Gain也会影响该值。正常人群样本的NeDCMn=145±5，NeOPMn=140±5，NeRLSMn=145±5。如果不在控，则可能也会造成仪器提示的假阳性与假阴性。