分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
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孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
加入酶底物显色形成斑点 （SPOT）
❖
基 本 操 作
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
Coating Ab 包被培养板
无菌
40C过夜
每孔加入200ul培养基 封闭 室温孵育1小时
在倒置显微镜下观察结果
❖技术要点
▪ 预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄） 会影响斑点的形成
▪ 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰
▪ 加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
▪ 细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培 养箱应保证稳定，避免震荡
▪ 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过 程避免细菌的污染以保证其效用
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
ห้องสมุดไป่ตู้
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育20-24小时
去除细胞
非无菌
PBST洗板
加入生物素标记 的detector Ab
室温孵育2小时后，PBST洗板
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
室温孵育1小时后，洗板
加入显色剂I/II, 暗处室温孵育20-30分钟
去离子水清洗培养板 室温干燥后
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
碱性磷酸酶streptavidin
斑点形成
细胞因子A 细胞因子B
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
加入酶底物显色形成斑点 （SPOT）
❖
基 本 操 作
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
Coating Ab 包被培养板
无菌
40C过夜
每孔加入200ul培养基 封闭 室温孵育1小时
在倒置显微镜下观察结果
❖技术要点
▪ 预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄） 会影响斑点的形成
▪ 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰
▪ 加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
▪ 细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培 养箱应保证稳定，避免震荡
▪ 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过 程避免细菌的污染以保证其效用
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
ห้องสมุดไป่ตู้
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育20-24小时
去除细胞
非无菌
PBST洗板
加入生物素标记 的detector Ab
室温孵育2小时后，PBST洗板
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
室温孵育1小时后，洗板
加入显色剂I/II, 暗处室温孵育20-30分钟
去离子水清洗培养板 室温干燥后
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
碱性磷酸酶streptavidin
斑点形成
细胞因子A 细胞因子B