酶联免疫斑点技术 - 360文档中心

酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用

提供，脑脊液Ｔ — ＮＰＲ）平 ≥５０ｃｐｅ／ｌ断为阳ＢＤＡ（Ｃ水０ｏｉｍ判ｓ
性，５０ｃｐｅｍ判断为阴性。检测结果使用Ｐｉ５０软＜０ｏｉ／ｌｓｒｍ．ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组间率的比较采用卡方
特异性ｒ扰素（Ｆ —）平可以用于结核分枝杆菌感染的干ＩＮｒ水
断为阳性，抗原检测结果为阴性，果判断为阴性；有３种结所脑膜脑炎病例均常规行脑脊液ＡＡ、脊液Ｔ — ＮＰＲ）Ｄ脑ＢＤＡ（Ｃ
检测。脑脊液ＡＡ使用酶标法进行检测，据国内同行Ｄ根２００４年对脑脊液ＡＡ在结核性脑膜脑炎中研究的标准ＪＤ，脑脊液ＡＡ１８ＵＬ判断为阳性，８ＵＬ判断为阴性；Ｄ＞／＜／脑脊
液Ｔ —ＮＢＤＡ荧光定量聚合酶链反应试剂由达安基因有限公司
选非结核性脑膜脑炎病例均通过临床治疗转归及实验室检查最终确诊。
方法
所有病例均抽取乙二胺四乙酸（ＤＡ）凝血５ｍ，ＥＴ抗ｌ送
实验室行Ｅｉｏ检测。检测结果根据斑点数量设定，一反ｌｐｔｓ每
术在结核性脑膜脑炎中的应用价值。
临床资料
、
果
在７例结核性脑膜脑炎的诊断中，ｌｐｔ性者４３Ｅｉｏ阳ｓ５

酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。

该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。

ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。

具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。

2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。

3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。

4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。

5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。

6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。

ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。

它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。

此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。

ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。

此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。

总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。

固相酶联免疫斑点技术

固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。

想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。

这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。

很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。

固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。

这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。

就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。

它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。

你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。

哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。

你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。

也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。

就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。

这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。

简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。

再说说检测的过程。

想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。

每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。

如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。

检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。

哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。

医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。

比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。

这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。

谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。

没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。

它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。

快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。

想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。

酶联免疫斑点法的操作方法

酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。

下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。

一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。

- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。

- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。

- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。

- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。

- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。

- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。

2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。

- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。

二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。

- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。

- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。

- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。

2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。

3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。

- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。

4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。

- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。

5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。

酶联免疫斑点技术 -回复

酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。

本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。

一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。

ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。

通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。

ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。

1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。

在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。

然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。

最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。

2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。

首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。

然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。

这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。

最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。

以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。

二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。

1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。

根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。

酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展

作者单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室通讯作者：张宗德，电子信箱：ｚｄ１＠１３ｃｒｚ４７６．ｏｎ
结核病与胸部肿瘤２００８年第４期胞。ＥＩＰ简单、稳定、灵敏，不受细胞ＬＳＯＴ因子代谢等因素的影响，可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况，能够比较真实地反映体内细胞因子的水平，ＥＩＰ现已被运用于各种疾病诊断和ＬＳＯＴ科学研究中。ＴＴ应用的纯化蛋白衍生物（ｕｉｅＳ所ｐｒｉｄｆｐｏｉｄｒａｖｓＰｒｔｎｅｉｔｅ，ＰＤ）是存在于结核分枝杆ｅｖｉ
产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中Ｙ干扰素（ＦＹ）是最为关键的细胞因子。因ＩＮ—
此，检￣ｌＮ— 水平或分泌ＩＮ— ｇＦＦＹ的效应Ｔ细胞的水平就可以判断是否存在结核感染。ＥＩＰＴ通过检测分泌细胞因子的细ＬＳ量夹，ＬＳＬＳＯＴ￣ＥＩＡ方法：
结核诊断技术，它是通过抗原特异性Ｔ巴细淋胞反应频率来检测结核感染患者的细胞免疫
功能。
１酶联免疫斑点技术的原理
结核病的免疫学机制主要是机体对结核
２９５
敏感度均为８％，健康成人中ＰＤ－ＬＳＯＴ０ＰＥＩＰ的敏感度为９％；英国健康成人中两种肽段８

检验科免疫学常见检测与分析方法

检验科免疫学常见检测与分析方法为了满足你的要求，我将按照“检验科免疫学常见检测与分析方法”的格式来书写文章。

以下是文章的正文：检验科免疫学常见检测与分析方法免疫学是研究机体免疫系统结构、功能及其介导的免疫反应的科学。

在检验科中，免疫学检测和分析方法广泛应用于疾病诊断、药物研发和医学研究等领域。

本文将介绍免疫学常见检测与分析方法，包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、流式细胞术和酶联免疫斑点法。

一、间接免疫荧光法间接免疫荧光法是一种检测抗体和抗原相互作用的方法，其原理是利用荧光素标记的二抗结合到已与目标抗原结合的抗体上，通过荧光显微镜观察荧光标记的二抗与抗原结合的情况。

这种方法具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的优点，因此被广泛应用于疾病的早期诊断和研究中。

二、酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。

该方法利用酶和底物的反应产生可见的颜色变化，从而判断目标物的存在和数量。

ELISA方法具有操作简单、灵敏度高和可扩展性强的特点，被广泛应用于病原微生物的检测、药物筛选和免疫学研究中。

三、流式细胞术流式细胞术是一种光学技术，用于分析和计数悬浮在流动液体中的细胞。

该方法通过染色和荧光素标记的抗体等实验步骤，通过流式细胞仪实时检测细胞的形态、大小、荧光强度等特征，从而实现对细胞种类和状态的分析。

流式细胞术在免疫学研究和临床诊断中的应用广泛，如检测白细胞亚群、免疫球蛋白等。

四、酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（ELISPOT）是一种高灵敏度、高特异性的单细胞分析技术，用于检测细胞产生的蛋白质分子。

该方法通过将待检细胞分泌的蛋白质与荧光素标记的抗体结合，通过荧光显微镜观察形成的颗粒斑点。

ELISPOT方法被广泛应用于评估免疫细胞的功能和活性，例如检测细胞因子的分泌和细胞毒性。

总结：免疫学在检验科中的检测和分析方法多种多样，包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、流式细胞术和酶联免疫斑点法。

ELISPOT技术简介及实验步骤

one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65

酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。

该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。

该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。

二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。

另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。

同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。

在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。

第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。

第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。

常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。

通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。

此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。

需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。

一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。

总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。

ELISA和ELISPOT检测技术

ELISA与ELISPOT检测技术
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
酶联免疫吸附试验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
酶标记物
底物溶液
E
E E E E E E E E
E
E
E
E
对照孔
参考液(不含抗原)
酶标记物
底物溶液
E
E E
E
E
E
E
测定孔
样本(含抗原)
竞争法ELISA实验原理
E
E
半定量ELISA试验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 37℃, 30min 洗涤3次，拍干加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

斑点酶联免疫吸附试验原理

斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。

•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。

2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。

•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。

步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。

2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。

3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。

4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。

5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。

6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。

7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。

3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。

•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。

•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。

4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。

•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。

酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用

（阳性率３．％）正常对照３７８，０例中有２例阳性（阳性率６７。结核抗体诊断结核病的灵敏度为３．％，．％）Байду номын сангаас８３特异
度为９．％；Ｐ３３ＰＤ试验痰菌阳性患者５７例中阳性２７例（阳性率４．％）痰菌阴性结核３７４，７例患者中阳性２０例（阳性率５．％）正常对照３４１，０例中有３例阳性（阳性率１．％）００。见表１。
观察结果，测量硬结（横径＋纵径）２均径 ≥５ｍ／，ｍ为阳
性反应，０～１ｎ为中度阳性，０ｍ或有水泡、ｌ９ｉｌｎ ≥２ｍ双
例数
５７３７３Ｏ
ＥＩＰＬＳＵｒ百分率结核抗体百分率ＰＤ试验百分率Ｐ
４２２７１７．３７７０３．３．３２２１４２３．８６３８７．６７．２７２０３４．７４５１４．１．００
２１００年第２２卷第８期
２１Ｖｏ．２Ｎｏ８００，１２．
上海预防医学杂志
Ｓａｇａｏｍ￣ｏｒｖｎｉｅＭｅｉｉｅｈｎｈｉＪｕｆＰｅｅｔｖｄｃｎ
文章编号：０４— ２１２１００２一０１０９３（００）８— ４ｔ２
１２方法．
③ 结核患者ＥＩＰＴ结核抗体、ＰＬＳＯ、ＰＤ试验的特征：ＥＩＰＴ试验阳性预测值为９．％，性预测值为ＬＳＯ８６阴５．％，ｏｄｎ指数为７．％，核抗体为阳性预测值３７Ｙｕｅ０１结

TSPOT分析

有学者指出：
诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为442SFCs/10^6 PBMC 。
排除活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为124SFCs/10^6 PBMC。
以72SFCs/10^6 PBMC为界值时,诊断活动性结核病的敏感性为71.9%,特异性76.4%,ROC曲线下面积为 0.810。
不能确定病变部位。
国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性可达到 78% ~100%, 特异性可达到80% ~100%。
国内学者研究应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性为83%~98.8%，特异性 65%~100%，阴性预测值81.8~91.6%，阳性预测值45.3~67.9%。
通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而PHA对照孔斑点数超过20个。
空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。当PHA对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去
（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行复查。 T-SPOT.TB的实验结果也有用每10^6 PBMCs中斑点形成细胞 (SFCs)的数目来描述，即SFCs／106PBMCs。
一、 T-SPOT.TB的原理
Lalvani建立以RDI编码的结核特异性抗原6KD早期分泌靶向抗原和10KD培养滤过蛋白肽段库为刺激源，检测外周血中结核特异性释放γ干扰素的T淋巴细胞。
二、结果的判断
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP-10)、阳性对照组(植物血凝素PHA)。

分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术

特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实验结果示意图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物

ELISpot检测技术操作要求及质量控制

ELISpot检测技术操作要求及质量控制作者：刘佳来源：《兽医导刊》 2017年第9期酶联免疫斑点检测技术(enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA) 基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。

由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。

但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。

因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。

一、细胞质量控制1. 采血。

选取45 ～ 50 日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。

采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。

震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。

2. 淋巴细胞分离。

6 h 内进行外周血单个核细胞(PBMC) 的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。

将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000 转/ 分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。

离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。

吸出中间环状乳白色PBMC 富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。

吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。

洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。

免疫斑点法原理

免疫斑点法原理
免疫斑点法（Elispot）是一种用于检测细胞分泌的免疫因子的技术。

其基本原理是利用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术，将特异性抗体包被在培养孔底部，然后加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被抗体捕获。

移出细胞后，板底留下自胞因子的潜在“影像”。

加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构。

再加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点。

最后通过斑点计数和数据处理，对结果进行分析。

以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅相关文献或咨询专业医生。

简述酶免疫技术的分类

酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。

它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。

酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。

它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。

ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。

2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。

免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。

3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。

该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。

4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。

快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。

酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。

通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。

ELISPOT酶联免疫斑点分析

ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。

在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。

80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。

因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。

两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。

•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。

细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。

酶联免疫斑点技术介绍

酶联免疫斑点技术介绍(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。

它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。

其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。

该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。

在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。

这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。

其二，单细胞水平，活细胞功能检测。

ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。

在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。

其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。

ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。

按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。

实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。

（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。

）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。

在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。