草鱼肌肉中诺氟沙星_恩诺沙星和环丙沙星的多残留检测

中图分类号 : S859 7
诺氟沙星( Norf lox acin) 、 恩诺沙星( Enro flox acin) 和环丙沙星( Cipro flox acin) 均属氟喹诺酮类 ( Fluoro quinolones, 简称 F QNS) , 为广谱性杀菌药 , 现已广泛应用于畜禽和水产养殖业, 但长期用药而导致其 在畜禽及水产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态影响等方面已被引起广泛关注[ 2] . 国内外用于检测 F QNS 残留的方法 , 主要有微生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法( H PL C) 、毛细 管电泳法等
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刘莉莉 , 等: 草鱼肌肉中诺氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的多残留检测
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结
果
诺氟沙星 、 恩诺沙星、环丙沙星的色谱行为 在上述色谱条件下, 诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星及内标物 ( 甲磺酸达氟沙星 ) 的保留时间分别为
9 62, 16 66, 11 14, 14 57 m in, 峰形良好 , 与肌肉组织中杂质分离良好( 图 1) .
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3
3 1
讨
论
[ 7- 8]
样品前处理条件的优化 1) 提取. 氟喹诺酮类药物结构上既有羧基又有哌嗪环, 具有酸碱两性 . 文献报道 采用甲醇、 乙腈、
二氯甲烷等纯有机溶剂提取, 国标方法 [ 9- 10] 则采用盐类缓冲溶液提取. 本试验比较了甲醇、乙腈、醋酸 乙腈、 磷酸- 乙腈分别作提取液的提取效果 , 结果以磷酸 # 乙腈按 25 # 75( v/ v ) 混合作为提取液 , 既能满 足蛋白沉淀的要求, 又能获得较高的回收率 , 同时后续浓缩也较方便. 2) 浓缩. 本试验比较了真空旋转蒸发至干和在氮气保护下浓缩至干[ 5] 两种浓缩方式, 发现二者回收率 并无差异 . 考虑到简便、快速, 我们选择应用了前者 . 进一 步比较温度对旋转蒸发的影响 , 选择 45 ! , 50 ! , 55 ! , 发现温度越高 , 蒸发速度越快, 而回收率并未发生较大改变 , 因此选择 55 ! . 3) 净化. 与国标方法
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表 3 草鱼肌肉组织中 3 种氟喹诺酮类药物的日内 和日间变异系数 ( n= 3) 添加浓度 /( g g- 1 ) 诺 氟沙星 1 849 9 2 039 3 3 327 0 3 552 5 日内变异系数 / % 恩诺沙星 2 757 5 2 764 9 3 507 1 3 923 6 环丙沙星 1 945 3 2 333 5 3 146 0 3 704 7 诺氟 沙星 3 991 7 4 113 5 4 355 0 6 183 9 日间变异系数 / % 恩诺沙星 4 489 4 5 612 7 6 227 2 6 866 1 环丙沙星 3 935 6 4 953 8 5 063 8 6 828 0
草鱼肌肉中诺氟沙星、恩诺沙星和 环丙沙星的多残留检测
刘莉莉 , 罗 忠3 ,
1, 2
罗
雷,
3
罗永煌 , 麦苏木4
1, 2
麦麦提江
1 西南大学 药学院 , 重庆 400716; 2 重庆市兽药工程技术研究中心 , 重庆 400715; 3 重庆百乐维克动物药业有限公司 , 重庆 401000; 4 新疆阿克苏职业技术学院 , 新疆 阿克苏 843000
注 : a: 标准品源自文库; b: 空白肌肉 ; c: 空白肌肉加标准品及内标物 ; 1: 诺氟沙星 ; 2: 环丙沙星 ; 3: 内标物 ( 甲磺酸达氟沙星 ) ; 4: 恩诺沙星 .
图 1 诺氟沙星 、恩诺沙星 、环丙沙星 HPLC 色谱图
2 2
回归方程与相关系数 诺氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星在 0 01~ 10 g/ g 范围内线性良好, 以峰面积比 ( x ) 对浓度 ( y ) 回归,
第 32 卷第 5 期 Vol 32 No 5
西 南 大 学 学 报 ( 自然科学版 ) Journal of Southw est U niv ersity ( N at ural Science Edit ion)
2010 年 5 月 May 2010
文章编号 : 1673- 9868( 2010) 05- 0171- 06
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)
诺氟沙星 95 75 ∃ 3 939 98 41 ∃ 3 9289 97 61 ∃ 4 251 99 45 ∃ 6 150
平均提取回收率 ( ∃ SD, % ) 恩诺沙星 91 02 ∃ 5 109 89 39 ∃ 4 013 87 41 ∃ 5 443 92 16 ∃ 5 683
环丙沙星 79 89 ∃ 4 046 80 38 ∃ 2 360 82 20 ∃ 5 613 84 15 ∃ 4 169
摘要 : 试验对草鱼肌肉的提取 、浓缩 、净化等环节进行了筛选 , 以甲 磺酸达氟沙星作内 标物 , 对流动相 、检测器 和 检测波长等色谱条件进行了选择与优化 , 在国标方法的基 础上 , 建立了草鱼肌肉组织中诺氟沙星 、恩诺沙 星和环丙 沙星 H PL C F L D 多残留检测方法 . 结果显示 , 以磷酸 - 乙腈作提取液 , 55 ! 真空旋转蒸发浓缩 , 正己烷脱脂净化 , 磷酸 - 乙腈作流动相 , 配合荧光检测器 ( 激发波长 280 nm, 发射波长 450 nm) , 在 0 01~ 10 g / g 范围内线性良好 , 回收率为 79 89% ~ 99 45% , 变异系数在 7% 以内 , 检测限均为 0 006 g / g . 为开展上述药物在草鱼中的 残留检测 以及残留消除规律的研究奠定了基础 . 关 键 词 : 草鱼 ; 诺氟沙星 ; 恩诺沙星 ; 环丙沙星 ; 多残留检测 文献标识码 : A
诺氟沙星 恩诺沙星 环丙沙星
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检测限、提取回收率及精密度 草鱼肌肉组织中 3 种药物的检测限均为 0 006 g/ g. 草鱼肌肉组织中添加不同浓度的 3 种药物, 其提取回收率见表 2, 变异系数见表 3.
表 2 草鱼肌肉组织中 3 种氟喹诺酮类药物的 提取回收率 ( n= 3) 添加浓度 /( g g
线性回归方程及相关系数见下表 1.
表 1 3 种氟喹诺酮类药物的线性回归方程及相 关系数 药 物 线性 回归方程 Y = 0 137 5 X - 0 0113 Y = 0 072 8 X + 0 007 Y = 0 163 6 X + 0 003 6 相关系数 0 999 80 0 999 90 0 999 95
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材料与方法
仪器与设备 岛津高效液相色谱仪 ; 岛津 RF 10AXL 型荧光检测器 ; H IT ACH I F 4500 型荧光扫描仪;
收稿日期 : 2009- 06- 24 基金项目 : 重庆市科委科技攻关资助项目 ( CST C, 2007A C1052) . 作者简介 : 刘莉莉 ( 1983- ) , 女, 湖南人 , 硕士研究生 , 主要从事兽医药理学与毒理学的研究 . 通讯作者 : 罗永煌 , 教授 , 研究生导师 .
[ 3- 6] [ 1]
, 各有优劣 , 其中 H P LC 是已报道的用于此类药物残留检测最常用的方法. 作者对草鱼肌
肉样品的提取、 浓缩、 净化等环节进行了筛选, 以甲磺酸达氟沙星作内标物, 对流动相、检测器和检测波长 等色谱条件进行了选择与优化 , 在国标方法的基础上 , 建立了草鱼肌肉组织中诺氟沙星、恩诺沙星和环丙 沙星 H P LC FL D 多残留检测方法. 现报道如下.
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FA2104A 型电子天平; JJ 2 型组织匀浆机 ; 酸度计 ; 旋涡混匀器 ; T G 16WS 型高速台式离心机; 旋转 蒸发仪; 微量移液器; KQ3200 型超声波清洗机 ; 其他实验室常用仪器 . 1 2 试剂和溶液 对照品 : 诺氟 沙星 ( 99 8% , 批 号: H 0070305) 、恩诺 沙星 ( 99 9% , 批号 : H 0080306) 、环丙 沙星 ( 99 8% , 批号 : H 0070607) 、 甲磺酸达氟沙星 ( 99 8% , 批号 : H 0200406) , 均购自中国兽医药品监察所. 乙腈、 甲醇、正己烷为色谱纯, 磷酸、三乙胺为分析纯, 三蒸水为实验室制备. 标准储备液 : 准确称取对照品诺氟沙星、恩诺沙星、 环丙沙星和甲磺酸达氟沙星各 0 005 0 g, 除甲磺 酸达氟沙星外, 均加入 1% 醋酸溶液 2 m L 溶解 , 用甲醇定容于 50 mL 容量瓶中 , 制成浓度为 100 g/ mL 贮备液, 存放于 4 ! 冰箱中. 使用时将其稀释至 1 g / mL , 为标准液 . 0 1 mo l/ L 磷酸溶液: 取 85% 磷酸 3 4 mL 用水稀释定容至 500 mL . 提取液: 取 0 1 mo l/ L 磷酸溶液 125 m L, 加入乙腈 375 mL , 充分混合 , 待用. 0 05 mo l/ L 磷酸溶液 ( pH 3) : 取 85% 磷酸 3 4 mL 用水稀释至 1 000 m L, 搅拌中滴加三乙胺, 调节 pH 值至 3. 1 3 液相色谱条件 色谱柱: H yper sil BDS C18 柱 ( 200 m m ∀ 0 46 mm , 5 m, 大连依立特 ) ; 流动相: 0 05 mo l/ L 磷酸溶 液( pH 3) - 乙腈混合液( 87 # 13, v/ v) ; 柱温 : 30 ! ; 流速 : 1 0 m L/ min; 检测器: 荧光检测器; 检测波长: 激发波长 280 nm, 发射波长 450 nm; 进样量 : 10 L. 1 4 样品前处理 草鱼肌肉样品制备: 去除草鱼鳞甲 , 沿背脊取肌肉 ( 包括皮肤 ) , 所取样品切为不大于 0 5 cm ∀ 0 5 cm ∀ 0 5 cm 的小块, 放置于- 20 ! 冰箱保存. 提取、 浓缩与净化 : 准确称取草鱼肌肉( 包括皮肤 ) ( 2 0 ∃ 0 005) g , 置 25 m L 聚丙烯离心管中, 加入 内标物标准液 40 L 和提取液 1 mL , 涡旋混合 1 m in, 匀浆 3 m in, 加入提取液 9 mL , 涡旋混合 1 min, 振 荡提取 15 min, 4 000 r/ m in 离心 10 min, 上清液转入另一离心管中; 再于沉淀物中加入提取液 10 mL , 涡 旋混合 1 m in, 振荡提取 10 min, 4 000 r/ m in 离心 10 m in, 得上清液 . 合并两次上清液, 4 000 r/ m in 离心 10 min, 取上清液置 50 mL 鸡心瓶中 , 55 ! 真空旋转蒸发至干 . 残渣用 0 1 mol/ L 磷酸溶液 2 mL 充分溶 解, 加入正己烷 5 mL , 充分振摇, 涡旋混合 30 s, 静置分层 , 取下层清液 , 12 000 r/ m in 离心 2 min, 取清 液, 过 0 22 m 微孔滤膜, 用滤液进样, H P LC FL D 测定 . 1 5 标准曲线绘制 用微量移液器吸取标准液 , 加入空白肌肉 ( 2 0 ∃ 0 005) g 中 , 按样品前处理方式处理后 , 浓度分别 依次为 0 01, 0 05, 0 1, 0 5, 1, 5, 10 g/ g, 依次按 H PL C F LD 分析 . 以诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星 峰面积与内标物峰面积的比值为横坐标 , 以样品中药物浓度为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 并计算回归方程 及相关系数. 1 6 检测限、提取回收率和精密度测定 分别准确称取空白肌肉( 包括皮肤 ) ( 2 0 ∃ 0 005) g, 做 5 个平行, 按样品前处理方法处理 , 测得基线 噪音平均值, 按 S/ N 为 3 计算, 求得该方法的检测限 . 称取空白肌肉 ( 包括皮肤 ) ( 2 0 ∃ 0 005) g , 按 4 个浓度梯度( 0 5, 0 1, 0 05, 0 01 g/ g ) 加入标准液. 按照前处理方式处理后, 每一浓度进 3 针, 按 H P L C FL D 分析 . 每个浓度每天做 3 个平行样品, 计算回收 率和日内变异系数, 连续测定 3 天, 计算日间变异系数 .