溶血空斑实验
溶血空斑试验
溶血空斑试验溶血空斑试验一、原理溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用图3131琼脂平板溶血空斑溶血空斑试验溶血空斑试验试验原理示意图下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
溶血空斑试验溶血空斑试验目前有关溶血空斑试验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑试验的操作方法简介如图3131。
溶血空斑试验溶血空斑试验二、材料和方法(一) 材料平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。
溶血空斑试验溶血空斑试验(二) 试剂1．SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次 2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7 2 P BS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×10 9/ml。
溶血空斑试验溶血空斑试验2．01mol/L pH值7 2 PBS(含Ca2+、Mg2+)。
3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。
将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。
4．DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。
5．补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。
抗体空斑实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体空斑实验的原理和方法。
2. 了解抗体形成细胞（B淋巴细胞）的功能和特性。
3. 通过抗体空斑实验检测和分析抗体生成细胞的功能。
二、实验原理抗体空斑实验（Plaque Formation Cell Assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，然后提取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液。
将细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，抗体形成细胞会释放出溶血素，导致周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量和大小可以反映抗体生成细胞的功能和特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 家兔或小鼠- 绵羊红细胞（SRBC）- 家兔淋巴结或小鼠脾细胞- 平皿、离心机、显微镜、温箱、水浴箱等2. 试剂：- Hanks液（含Ca2+、Mg2+）- PBS（含Ca2+、Mg2+）- 底层琼脂（1.4%）- 表层琼脂（0.7%）- 补体（新鲜豚鼠血清）- 小牛血清（56℃灭活30min）四、实验步骤1. 免疫动物：将绵羊红细胞免疫家兔或小鼠，使其产生抗体。
2. 制备细胞悬液：取出家兔淋巴结或小鼠脾细胞，制成细胞悬液。
3. 准备琼脂平板：将底层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
4. 混合细胞悬液：将细胞悬液与SRBC混合，加入适量的补体。
5. 倒平板：将混合液倒入平皿中的底层琼脂上，待凝固。
6. 覆盖表层琼脂：将表层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
7. 温育：将平皿放入温箱中，37℃温育24-48小时。
8. 观察：用显微镜观察溶血空斑的形成情况。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 观察到平皿中形成了多个溶血空斑，每个空斑大小不一。
- 空斑数量较多，说明抗体生成细胞的功能较强。
2. 结果分析：- 溶血空斑的形成表明实验动物产生了抗体。
- 空斑数量和大小反映了抗体生成细胞的功能和特性。
溶血空斑实验报告
一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。
2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。
3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。
二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。
其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。
一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。
2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。
（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。
（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。
（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。
（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。
四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。
（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。
2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。
（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。
（3）加入适量表层基，轻轻混匀。
（4）加入适量补体，轻轻混匀。
（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
实验二溶血空斑meng
眼球取血 → 处死小鼠 → 取脾→用10ml洗 液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清，加 裂解液2ml，混匀，2min后离心（转数、时间 同上）→弃上清加洗液10ml，混匀，离心 （同上）
2.用100μl的微量进样器吸取被检细胞混 合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两 个小室。记录实际注入的悬液微升数。
3. 将做好的标本水平放置37℃温箱中， 孵育30 分。
【结果分析】
结果观察及溶血空斑计数。
1.肉眼观察空斑 ，计数两个小室出现的溶血空 斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检 查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴 细胞，周围为透明区。
加样
10ul 细胞悬液
玻片小室的制作
取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 和一条10mm 的双面胶，然后用小镊子取 二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室， 用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。
细胞混悬液的配制及灌注
1.取小试管一支，用1ml吸管取0.2ml指示 细胞悬液；0.2ml 500倍稀释的脾细胞 悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大 方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论 是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方 格数都是相同的，即16×25=400小方格。
示意图
细胞计数板的使用
1mm
A
2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：
脾细胞悬液总毫升数（即为50ml）
抗体产生细胞总数＝
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
溶血空斑实验报告
溶血空斑实验报告溶血空斑实验报告一、引言溶血空斑实验是一种常用的实验方法，用于评估溶血性物质对红细胞的影响。
通过该实验，我们可以了解不同物质对红细胞膜的破坏程度，进而评估其溶血性质。
本实验旨在通过观察溶血空斑的形成情况，探究不同浓度的溶血物质对红细胞的影响。
二、实验方法1. 实验材料准备本实验所需材料包括：新鲜的动物全血、不同浓度的溶血物质（如甲醇、氯仿等）、生理盐水、离心管、显微镜等。
2. 实验步骤（1）将新鲜的动物全血收集到离心管中，离心3500转/分钟，5分钟，将上清液去除，留下红细胞沉淀。
（2）用生理盐水洗涤红细胞沉淀，重复上述离心步骤，去除上清液。
（3）将洗涤后的红细胞沉淀与不同浓度的溶血物质混合，如1:1、1:2、1:4等比例。
（4）将混合液搅拌均匀，然后离心3500转/分钟，5分钟。
（5）观察离心管底部是否出现溶血空斑，记录结果。
（6）将观察结果用显微镜进行进一步观察和拍照。
三、实验结果在本次实验中，我们使用了不同浓度的溶血物质对红细胞进行处理。
观察结果显示，随着溶血物质浓度的增加，溶血空斑的数量和大小也呈现出增加的趋势。
当溶血物质与红细胞比例为1:1时，溶血空斑较少且较小；而当比例为1:4时，溶血空斑明显增多且较大。
四、实验讨论通过本次实验，我们可以得出以下结论：1. 溶血物质的浓度对红细胞的溶血性有明显影响。
随着溶血物质浓度的增加，红细胞受损程度加剧，溶血空斑的形成也更为明显。
2. 溶血空斑的形成是红细胞膜受到破坏的结果。
溶血物质与红细胞膜相互作用，导致膜的破坏，从而使溶血空斑形成。
3. 不同溶血物质对红细胞的溶血性质可能存在差异。
在本实验中，我们使用了甲醇和氯仿作为溶血物质，观察到它们对红细胞的溶血性质不同。
这可能与两种物质的化学性质和作用机制有关。
五、实验意义溶血空斑实验是一种常用的实验方法，广泛应用于生物医学研究领域。
通过该实验，我们可以评估不同物质对红细胞膜的破坏程度，了解其溶血性质。
经典溶血空斑实验的原理
经典溶血空斑实验的原理在经典的溶血空斑实验中，首先需要准备红细胞悬液和抗血清。
红细胞悬液可以通过离心血液样本获得，而抗血清可以是已知含有特定抗体的人类或动物血清。
抗血清里的抗体能与红细胞上的抗原决定基结合并引起免疫反应。
实验开始前，需要配制一定浓度的抗血清稀释液。
为了确定正常血清对红细胞的影响，还需要准备一组对照试管，其中只加入红细胞悬液，不加入抗血清。
此外，还要准备一组阴性对照试管，其中既不加入抗血清，也不加入红细胞悬液。
接下来的步骤是将相应的抗血清和红细胞悬液混合。
通常，将一定量的抗血清与一定体积的红细胞悬液混合于平板或试管中。
然后，将混合物在适当条件下培养一段时间（通常为1-2小时），使抗体和红细胞发生反应。
在一定的反应时间后，观察混合物的现象。
如果抗体与红细胞上的抗原决定基结合，那么红细胞可能会发生凝聚或溶解。
凝聚通常表现为红细胞的团块状聚集，而溶解则表现为呈现空心的透明空斑。
观察结果后，可以通过显微镜直接观察试管内的现象或者使用显微镜将聚集后的红细胞和溶解后的空斑在幻灯片上涂片，然后在镜下观察。
通过对比不同试管内的结果，就可以初步判断存在的抗体种类。
如果一个特定抗体与待测的红细胞悬液混合后形成了空斑，那么可以推测该血液样本中存在该抗体。
相反，如果加入正常血清后试管中没有出现空斑或聚集现象，那么可以认为该血液样本中没有与正常抗体反应的抗体。
需要注意的是，溶血空斑实验只能初步判断抗体的存在，不能确定抗体的种类，因为不同抗体对红细胞的作用机制不同，有的抗体可以引起热凝集现象，有的可以引起冷凝集现象，而有些抗体则可以引起溶解等。
所以，在鉴定抗体种类时，还需要进行进一步的试验，如冷凝集试验、ELISA等。
在实际应用中，溶血空斑实验被广泛用于免疫学研究、血型鉴定、自身免疫性溶血性贫血的诊断等。
通过检测抗体与红细胞之间的反应，溶血空斑实验为临床诊断提供了有力的工具。
同时，该实验的原理也为研究免疫学和血液学提供了实验基础。
溶血空斑实验的原理及应用
溶血空斑实验的原理及应用1. 溶血空斑实验介绍溶血空斑实验是一种常用的实验方法，用于检测溶血素和溶血抗体对红细胞产生的溶血现象。
通过此实验可确定溶血素或溶血抗体对红细胞膜的破坏能力。
2. 溶血空斑实验的原理溶血空斑实验的原理基于溶血素或溶血抗体与红细胞的相互作用。
溶血素或溶血抗体与红细胞结合后，会导致红细胞膜破坏，形成溶血空斑。
3. 溶血空斑实验的步骤溶血空斑实验的步骤如下：•选择适当的红细胞供试验•准备适当稀释的溶血素或溶血抗体溶液•将稀释的溶液与红细胞混合，孵育一段时间•离心样品，观察沉淀•根据结果判断溶血程度4. 溶血空斑实验的应用溶血空斑实验在许多领域有广泛的应用，包括以下几个方面：4.1 血型鉴定溶血空斑实验可用于血型鉴定。
通过将不同血型的红细胞与已知抗血清进行反应，观察是否出现溶血空斑，从而确定血型。
4.2 疾病诊断溶血空斑实验可用于某些疾病的诊断，如溶血性贫血。
溶血性贫血的患者红细胞易受到溶血素的破坏，通过溶血空斑实验可以检测红细胞抵抗溶血的能力。
4.3 药物毒性测试溶血空斑实验还可用于药物毒性测试。
某些药物可能对红细胞膜产生损伤，通过溶血空斑实验可以评估药物的毒性。
4.4 免疫学研究溶血空斑实验在免疫学研究中也有重要应用。
通过溶血空斑实验可以检测抗体与红细胞间的相互作用，从而研究免疫反应机制。
5. 结论溶血空斑实验是一种常用的实验方法，可用于血型鉴定、疾病诊断、药物毒性测试以及免疫学研究等领域。
通过观察溶血空斑的形成情况，可以了解溶血素或溶血抗体对红细胞的影响，为相关领域的研究和诊断提供一定的依据。
医学免疫学：溶血空斑试验(PFC测定)
• 实验目的：
1. 掌握PFC试验的基本原理及实验方 法；
2. 了解PFC试验的临床意义。
实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
实验材料
• 小鼠18～22g， • 5％、15％SRBC，补体，Hank’s液， • 解剖器械（剪刀、镊子）， • 空平皿、筛网、组织研磨器、吸管、试管、离心
机， • 载玻片、双面胶、微量加样器、Tip头、棉签、石
蜡、石蜡锅、温箱等。
1.脾细胞悬液的制备
5％ SRBC 0.4ml腹腔内注射免疫小鼠
实
验
4d后
流பைடு நூலகம்
颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，放入已加8ml Hank’s液的平皿中，研磨，200目筛网过滤
程
离心：1000r/min×10min
去上清，加2ml Hank’s液制成脾细胞悬液
2.制作小室
取洁净载玻片两张
实
验
用双面胶在中间和两端各粘一条，将
流
两张玻片黏在一起即成2个小室
程
3.配制小室灌注液
准备2支试管，按照下表加样：
实 验 脾细胞悬液 流 15%SRBC 程 补体
实验管（μl） 对照管 （μl）
100
100
100
100
100
-
Hank’s液
500
600
混匀，分别灌注小室（注满），石蜡封口，
溶血空斑试验（PFC测定）
(Plaque forming cell assay)
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体， 溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外 试验方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典 的试验。
溶血空斑实验的原理
溶血空斑实验的原理1.实验原理：溶血空斑实验主要基于抗原和抗体之间的免疫反应。
当免疫系统受到感染或免疫原刺激时，抗体将与抗原结合，形成免疫复合物。
在溶血空斑实验中，将已知浓度的抗体与红细胞溶菌素处理的红细胞混合，然后加入琼脂糖琼脂培养基中，使混合物凝固。
在凝固过程中，溶菌素溶解琼脂糖，形成无菌区域，也就是空斑。
抗体与抗原结合后，免疫复合物被固定在空斑上。
2.溶血空斑的形成：溶血空斑的形成是通过抗原抗体反应导致的。
在实验中，抗原通常是从被测物中提取的细菌、病毒或其他病原体的产物，抗体则是抗生素和其他免疫反应生成的。
当抗原与抗体结合时，它们组成了免疫复合物。
这些复合物随后被固定在琼脂糖琼脂培养基中，形成圆形的空斑。
3.抗原抗体反应的强度：空斑的大小和数量取决于溶血抗原抗体反应的强度。
当抗体与抗原结合时，抗原抗体复合物会激活补体系统，引发溶血反应。
补体系统的活化会导致细胞膜的破坏，从而使红细胞溶解。
溶血反应越强烈，空斑越大。
因此，通过观察空斑的大小和数量，可以定量评估抗原抗体反应的溶血效应。
4.实验步骤：（1）制备琼脂糖琼脂培养基：将琼脂糖溶于琼脂基础培养基中，使其凝固。
（2）制备抗原抗体混合物：将已知浓度的抗体与红细胞溶菌素处理的红细胞混合。
（3）将抗原抗体混合物加入琼脂糖琼脂培养基中，使其固化。
（4）放置琼脂糖琼脂培养基在适宜的条件下孵育，并观察空斑的形成和大小。
（5）使用计数板或计算机软件，记录并计算空斑的数量和大小。
溶血空斑实验在免疫学研究中具有重要应用，可以被用于评估抗原抗体反应的强度和效果。
通过该实验，可以识别和定量分析具有溶血活性的物质，例如细菌外毒素、补体系统中的抗体和病毒。
它也可用于评估药物或化合物的溶血活性，以及观察疫苗的保护性能力。
总之，溶血空斑实验为研究和评估免疫反应中的溶血效应提供了重要的定量工具。
2012年医学检验辅导之溶血空斑形成试验
2012年医学检验辅导之溶血空斑形成试验2012年医学检验临床检验技师辅导之溶血空斑形成试验2012年医学检验临床检验技师辅导：溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验：经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置37℃温育。
由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。
每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
这种直接法所测的细胞为IgM生成细胞，其他类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA 与抗Ig抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验。
但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。
如果用一定方法将SRBC用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的应用范围较大。
现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验。
SBA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围。
在该测试系统中，加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc段可与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。
此法可用于检测人类外周血中的IgG产生细胞，与抗体的特异性无关。
用抗IgA、IgG或IgM抗体包被SRBC，可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，这种试验称为反相空斑形成试验。
实验二溶血空斑
?
弃上清加 4.9ml洗液混匀
?
取0.1ml脾细胞悬液 +0.9ml洗液（A液），混 匀
?
? 取0.1ml（A液）+小室（约用 30ul）
细胞计数板（Hemacytometer）
? 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上 由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短 横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方 格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大 方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中 进行。
? 将绵羊红细胞（ SRBC）免疫过的小鼠脾细胞 制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合， 在补体参与下，使抗体产生细胞周围的 SRBC 溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要 用于测定 B细胞抗体产生能力。
【试剂与器材】
1. 健康小鼠（约 18～20 克重）。 2. 绵羊红细胞悬液（ 2.5%）。 3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液
于小鼠腹腔内。（ 4 天后追加一次免疫效果 更佳）。 ? 见试验一，已做
制备脾细胞悬液
1.将免疫后 7 天的小鼠颈椎脱位处死， 75%乙醇浸泡 3 分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；
2.在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁， 可见红色长条状脾脏；
3. 在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用 镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织， 取出脾脏。放入盛有 5ml Hanks 液的培养皿中；
1mm
A
1mm B
1ml=1cm 3=1000mm 3
A+B+C+D
细胞数=
? 104 ?稀释倍数
4
C
D
6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。 吸取此悬液 0.1ml 放小试管中，再加 0.9mlHank′s 液，即为 500 倍稀释的脾细胞 悬液。
溶血空斑实验..
（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处， 用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑 的溶血状况，并记录整个平皿中的 空斑数，同时求出每百万个脾细胞 内含空斑形成细胞的平均数。
●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B
细胞 ），空斑的数量反映机体的体液 免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微 镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度 为2.00×109个/mL
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种 浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊 子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）
经典溶血空斑实验的原理
经典溶血空斑实验的原理经典溶血空斑实验是一种常用于研究溶血现象的实验方法。
其原理是通过控制不同浓度的溶血试剂与红细胞悬液反应，观察溶血现象的发生情况，从而了解溶血试剂的溶血效果。
下面列举了经典溶血空斑实验的原理：1. 溶血现象：红细胞在一定条件下受到破坏，导致红细胞内部的血红蛋白溶解出来，形成溶血现象。
2. 溶血试剂：溶血试剂是一种具有溶解红细胞膜的特性的物质，常用的溶血试剂有生理盐水、蒸馏水、酸、碱等。
3. 红细胞膜：红细胞膜是红细胞的外层膜，由磷脂、蛋白质和糖组成，具有一定的韧性和弹性。
4. 溶血试剂与红细胞膜的作用：溶血试剂能够破坏红细胞膜，使血红蛋白溶解出来。
5. 溶血程度的测定：通过观察红细胞悬液与溶血试剂反应后形成的溶血空斑的大小和数量，来判断溶血程度的大小。
6. 溶血空斑的形成：红细胞悬液与溶血试剂反应后，红细胞膜受到破坏，血红蛋白溶解出来形成空斑。
7. 溶血空斑的观察：溶血空斑呈现出透明的圆形区域，周围是红色的红细胞残片。
8. 溶血程度的判断：溶血程度的大小可以通过观察溶血空斑的大小、数量和形状来判断，溶血程度越大，空斑越大、数量越多。
9. 溶血试剂浓度的影响：溶血试剂的浓度越高，其溶血效果越强，溶血程度越大。
10. 环境因素的影响：温度、pH值等环境因素也会影响溶血试剂对红细胞的溶血效果。
11. 应用范围：经典溶血空斑实验可以用于检测溶血性贫血、溶血性疾病等，也可以用于研究溶血机制和溶血试剂的效果。
经典溶血空斑实验是一种简单、直观的实验方法，通过观察溶血空斑的形成和溶血程度的大小，可以初步评估溶血试剂的溶血效果。
这种实验方法广泛应用于临床医学、生物医学研究及药物研发领域，对于研究溶血机制和溶血性疾病的发生发展具有重要的意义。
溶血空斑试验第二次2
溶血空斑试验【实验结果】图溶血空斑在第一次实验失败的基础上，我们改善了实验步骤与实验用品，经过大家的不懈努力终于获得了以上实验结果。
图片描述：在平皿中，肉眼观察可见空斑为边缘整齐的圆形透明区。
可在低倍镜下鉴定，溶血空斑中心一定有一个淋巴细胞，周围为透明区。
【实验总结】1)两次实验在实验方法与用品方面的比较：第一次实验第二次实验第二次实验结果小鼠的免疫时间所有小组的小鼠免疫时间均不到四天四个小组分成两部分，分别是对小鼠提前两周免疫和提前四天免疫，观察免疫时间的长短对实验结果的影响。
从整个实验结果来看，免疫四天的小组其中一组可观察到溶血空白，而免疫两周的没有，不过由于实验过程中还出现了其他的问题，因此不能说明免疫时间的长短对实验结果的影响。
SRBC 的浓度有的淋巴细胞周围的SRBC较少准备的绵羊红细胞是以1:5的比例与PBS混合实验中，显微镜下观察绵羊红细胞比较多，而且分布均匀，有利于实验结果的观察。
补体的获取兔子太小，不能获得耳缘静脉血清，而是直接处死获得全血，再离心获得血清。
这期间由于时间较长，血液凝固，采用PBS稀释离心获得血清，可能因此造成了补体活力的降低。
将三只豚鼠血混合，获得新鲜的补体。
由于补体有很多种，采用三只豚鼠的血液，能够避免补体的单一性对实验结果造成影响，更加有利于补体活力的提高。
此次实验结果的成功，就已经证明了实验方法改善的合理性。
2)此次实验中也存在了以下问题：在对豚鼠血进行离心获得血清时，有两管的血清始终呈红色，可能是红细胞破碎了的缘故；在表层琼脂加入补体时，琼脂碎了，其中的原因有待考虑（起初以为是0.7%琼脂之水浴是进入了水，可是后来证实不是）。
3)在此次实验中，能够运用正确的方法熟练地给小鼠注射麻药，改正以前操作的错误。
实验二溶血空斑
实验二溶血空斑实验目的：了解血液抗原与抗体的作用，掌握血凝反应的基本原理和实验方法，了解溶血空斑试验的原理，探讨影响溶血空斑的因素。
实验原理：人和动物的血液表面都有各种化学物质，其中最明显的有抗原和抗体。
血型抗原通常是在红细胞的表面，而血型抗体则在血清中。
在正常情况下，抗原与抗体之间不会产生相互作用，但是在体外与不同类型的血液混合时就会出现反应。
在血凝反应过程中，当同种抗体与同种抗原相遇时，它们会结合起来形成一个可见的团块。
抗体对于外来抗原有着高度的选择性，即其能够选择性的结合到特定的抗原，而不涉及其他抗原类型。
通常存在四种血型：A、B、AB、O。
每一种血型都有特定的抗体和抗原。
溶血是指红细胞破裂释放出细胞内物质的过程。
红细胞的膜结构具有半渗透性，并且固定量的抗体或淀粉样物质能与它们结合。
当不兼容的血液混合时，体内的抗体结合到血型抗原表面，从而导致血细胞的破裂和血液中出现游离的血红蛋白，也称为溶血现象。
溶血空斑试验是一种检测抗体特异性和浓度的试验。
在试验中，试管中的血浆加入已知抗原类型的红细胞悬液，然后让其稀释，最终加入悬液的红细胞浓度足以产生溶血空斑。
抗体与相应抗原结合时会在红细胞表面形成网状结构，称为空斑。
空斑在显微镜下呈现为圆形透明的结构，其大小和数量取决于抗体浓度和特异性。
抗体浓度越高，抗体与红细胞结合的位置越小，空斑越大。
实验步骤：设计课题：本实验选择 ABO 血型系统，探究不同抗体浓度对溶血空斑的影响。
器材：平滴管5ml，离心机，显微镜，石蜡片，波茨玻璃吸管，无菌吸球，超声波清洗器。
试剂：离心管，血型鉴定血清（A、B、O）、丙酮、0.9％生理盐水、0.3％凝血酶液、4％牛血清蛋白、洗涤缓冲液。
操作流程：1.实验器材的清洗：取下一个 50 毫升的玻璃容器，加入浓度为 10% 的氢氧化钠溶液，用玻璃棒搅拌，再洗净，然后反复用蒸馏水洗净。
之后，使用超声波清洗器清洁吸球。
将使用密闭器前的所有仪器和试剂清洗，使其无残留物和干净。
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思考题
• 溶血空斑实验的意义？
注意事项
⒈ 对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也是 靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤 不超过3次，每次2 000r/min离心5min，细胞 变形或脆性增大者均不能使用。 2．免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以 2.00×104 个/0.2ml为宜。腹腔注射为 4.00×108 个 /ml，用量小，如低于1.00×107个 /ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超 过2.50×109个/ml，不能形成空斑。
（四）加补体 • 从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀 释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃ 温箱中温育30min后取出，观察溶血 空斑。也可在室温下放臵1h，4℃冰 箱过夜，次日观察结果。
结果判定
观察时，将平皿对着光亮处， 用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑 的溶血状况，并记录整个平皿中的 空斑数，同时求出每百万个脾细胞 内含空斑形成细胞的平均数。
3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹 腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或 过晚空斑都形成极少。 4．脾细胞的活力： 为了保证脾细胞的活力，制 备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最 好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过 程应在冰浴中进行。 5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好 温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。
●一个空斑代表一个抗体形ห้องสมุดไป่ตู้细胞（即B
细胞 ），空斑的数量反映机体的体液 免疫功能。 ●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的 多少。由于溶血空斑试验具有特异性高， 筛选力强，可直接观察等优点，故可用 做判定免疫功能的指标，观察免疫应答 的动力学变化，并可进行抗体种类及亚 类的研究。
实验材料与试剂
• 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微 镜 • 试剂： ①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS 离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用 PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度 为2.00×109个/mL
6．补体的活力：补体活力的大小，对溶 血空斑的形成关系很大。如出现抗体或 补体的活力低下，将不能形成空斑。所 以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清 混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化 补体。 7．空斑计数：要求判读准确，避免辨认 造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检， 对肉眼结果进行核对。
• 所以器皿和各种试剂在加入表层基前均 需预温。 • SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准 确。 • 免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个 体差异大，难以比较，最好先作几次预 实验，使每个玻片空斑数控制在100-200 个为宜。
（二）倾注底层琼脂 • 将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于 水平位臵的平皿内，每皿6ml，凝固 后，用前臵55℃水浴锅中预温。
（三）表层琼脂的制备 • 将0.7%的琼脂融化后，臵于55℃恒温 水浴箱中，依次加入以下试剂： • ⑴ 20%SRBC悬液0.1ml。 • ⑵ 小牛血清0.1ml。 • ⑶ 5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。 迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂 的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静 臵约15min，放37℃温育2h。
②Hanks液（含Ca2+、Mg2+ ） ③底层基（1.4%）和表层基（0.7% ）： 将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种 浓度。将表层基分装于小试管中，每管 2ml ④补体：新鲜豚鼠血清 ⑤小牛血清：56℃灭活 30min
实验步骤
㈠免疫脾细胞悬液的制备 ①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬 液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108 个 /1ml。 ②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小 鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS 中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊 子挤压脾脏，稍静臵，吸上清液至离心管中， 2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS 液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为 5×106个/ml）
抗体生成细胞检测 ——溶血空斑实验
微生物与免疫教研室
实验目的
• 掌握溶血空斑试验检测原理 • 掌握溶血空斑的操作方法
实验原理
●溶血空斑实验（plaque forming cell assay,PFC ） 体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一 种方法。 ●其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠， 取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一 定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性淋巴细 胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围 的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形 成一个可见的溶血空斑。