水稻原生质体分离与转化方法2014-01-20

水稻原生质体分离与转化方法

（储成才 课题组 2014-01-20）

【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。

一、实验的前期准备：

1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。

2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。

二、试剂和耗材：

1. 耗材：耗材准备如下表所示。

50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液

250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体

A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片

玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台

50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体

2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化

双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘

0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液

细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体

2. 试剂准备：

(1) Enzyme solution

0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g

10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g

1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g

0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 g

D-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。用1M KOH 调pH 至5.7，然后65℃水浴10min ，过0.22μM 滤膜除菌至无菌三角瓶中（注意pH 值一定要准确，否则将极大的影响原生质体的制备效率。Cellulase R-10可以用Cellulase RS 代替，但是Cellulase RS 的最适pH 大约为6.0左右）。待酶液冷却至室温后，加入如下试剂： 0.1% BSA

0.025 g 0.05 g 0.1 g 3.4 mM CaCl 2 (M=110.99) 0.0095 g 0.019 g 0.038 g 50 mM β-ME (14.3 M) 8.75 μL 17.5 μL 35 μL

50 μg/ml Carbenicillin

1.25 mg

2.5 mg

5 mg

(CaCl 2可配制1M CaCl 2，然后加入85 μL/ 25 mL ，Carbenicillin 配制50 mg/ mL 的母液)。 (2) W5 Solution 154 mM NaCl (M=58.44) 0.9 g 1.8 g 3.6 g 125 mM CaCl 2 (M=110.99) 1.39 g 2.78 5.56g 5 mM KCl (M=74.55)

0.037 g 0.074 g 0.148 g 2 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.039 g

0.078 g

0.156 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (3) MMg Solution 0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 10.93 g 15 mM MgCl 2 (M=95.22) 0.143 g 4 mM MES (M=195.24, pH=5.7)

0.078 g

用1M KOH 调pH 至5.7 , 121℃灭菌20 min 。 (4) 40% PEG Solution 0.6 M D-Mannitol 0.546 g

10.93 g 100 mM CaCl 2

0.5 mL (1M CaCl 2) 1.11

g 40% (v/v) PEG 4000 (Fluka, Sigma-Aldrich )

2 g (体积约等于1.75 mL)

40 g

Tips ：由于PEG 吸水后体积会膨胀，所以必须在定容前给PEG 留出一部分体积。配制该

溶液时先溶解D-Mannitol 和CaCl 2后，再加入PEG ，65℃水浴加热10min 至完全溶解后，再定容到最终体积。

三、实验步骤

1. 原生质体制备：

(1) 预先配制0.6 M D-Mannitol 溶液100 mL 。

(2) 将培养的水稻苗从茎基部截断后，用刀片切成0.5 mm 薄片，每次4-5颗苗/1个刀片(茎部比较好，叶片的细胞比较小，去除衰老的叶鞘)。将切好的水稻细条迅速转移入0.6 M D-Mannitol 溶液中，在常温下60-80 rpm 培养30 min 。