PMP柱前衍生高效液相色谱法-终版

糖组成分析（PMP-HPLC）
混合单糖标准品的准备：
称取各单糖标准品（L-Fuc；L-Rha；L-Ara；L-Xyl；D-Man；D-Gal；D-Glc；D-GalA；D-GlcA）溶于去离子水中，配成1mg/ml以待分析。

多糖的水解
称取2-4mg多糖样品于鸡心瓶（10ml）中，加入1ml H2O预溶，再加入1ml 4M的TFA，橡皮膏封闭瓶口，置110℃烘箱中水解（中性多糖水解2h，酸性多糖水解4h）；冷却至室温后，加甲醇多次（4次）除去多余的TFA至无酸味；水解的多糖样品复溶于200μLH2O。

单糖的PMP衍生化
取50μL多糖水解液或50μL混合单糖标准品溶液于2ml EP管中，分别与50μL的0.6mol/L 的NaOH溶液充分混合，加入100μL 0.5mol/L的PMP（0.2613g/3ml）甲醇溶液，塞紧塞子封紧后，漩涡振荡仪混匀；在70℃水浴中反应100min，取出冷却至室温。

加入100μL 0.3 mol/L 的HCl中和，再加700μl去离子水以及1ml氯仿萃取，漩涡振荡，静置1-2h。

吸取上层水相900μl，再加入900μl的氯仿萃取一次，静置1h，再去上层水相800μl，再加入800μl 的氯仿萃取一次，或用低速离心代替静置处理。

用带有0.22μm微孔滤膜的注射器过滤后，装入液相瓶中待HPLC进样分析。

HPLC分析糖组成
Agilent 1260高效液相色谱系统
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm, 5μm；
流动相：Buffer A: 15%乙腈+85%磷酸盐缓冲液
Buffer B: 40%乙腈+60%磷酸盐缓冲液
磷酸盐缓冲液：0.05M 磷酸二氢钾缓冲液（pH 6.7）
KH2PO4 13.6g及NaOH 1.8g溶液2L水中；
乙腈（HPLC级）；
时间（min）Buffer A Buffer B
0 100 0
10 90 10
30 80 20
35 80 20
45 80 20
45.01 100 0
55 100 0
柱温：20℃；
紫外检测波长：254nm；
流速：1ml/min；
进样体积：20μl。