限制性片段长度多态性 RFLP课件

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RFLP技术的步骤
DNA先酶切，电泳分离，变性后转移到尼龙膜 或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交， 最后做放射自显形，就可检测出多态性条带。
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PCR扩增目的片断 凝胶电 泳分开 DNA片 段 转膜
South ern杂 交
数据分 析
不同个 体DNA 的提取
就是通常指的DNA 限制性内切酶，II型 限制酶分子量小、仅 需Mg2＋作为催化反 应辅助因子。它们能 识别双链DNA的特异顺 序，并在这个顺序内进 行切割，产生特异的DN A片段。
与I型酶特性类似，也 有甲基化功能。不同 的是它能在DNA链上 的特异位点切割，其 切割位点在识别位 点以外，对基因工程 的意义也不大
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RFLP的类型
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1.点的多态性 表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有 酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交 即可诊断。 2.序列多态性 ①由于DNA 顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。 ②由于高变区（highly variable region ）内串联重复顺序 的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别 位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中 的相对位置。
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RPLF技术的原理
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利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因 组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布 情况。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆 DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
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RFLP中应用的限制性内切酶
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限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
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酶切
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一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些 特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。 切割DNA的条件可根据不同目的设定，有时可采用部分 和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA 片段。 消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即 可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩 DNA样品后再进行电泳分离。
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三种限制性内切酶
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I型酶
II型酶
III型酶
如酶的识别位点上 两条DNA链均未甲 基化，就行使内切酶 功能，但切割点不在 识别位点，而在1kb （不少于400bp）或nk b(最多7kb)处随机切割.
限制性片段长度多态性 RFLP
限制性片段长度多态性RFLP
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1
RFLP技术的简介
2
RFLP中应用的限制性内切酶
3
RFLP的实验步骤
4
RFLP技术的应用
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分子标记的历史
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第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism， 限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机 扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism， 扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分 子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
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RPLF技术的简介
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个体差异差异大多数都是由于不编码蛋白质的区域和没有 重要调节功能的区域发生中立突变。这些突变构成的差异 成为DNA多态性。 假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部 位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。 这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与 正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现 不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP ）。 RFLP作为一种“遗传路标”，对人类基因组制图提供必 要的标记，当多态性顺序与人类遗传性疾病位点连锁时， 可作为遗传缺陷的产前诊断或是鉴别携带者的标记，还可 以应用于亲子鉴定和群体研究等方面。
酶切
抽提DNA或PCR扩增后的DNA经内切酶酶 切, 然后在琼脂糖凝胶电泳分析，适合较 小分子的DNA分析
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不同个体DNA的提取
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1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨 破碎组织中的细胞； 2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA； 3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。
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凝胶电泳分开DNA片段
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在恒定电压下，将DNA样品放在0.8～1.0%琼脂糖凝胶 中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70－ 80000bp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。 分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段 DNA则需要浓度较高的胶。 另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样 品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量 DNA （DNA marker）进行电泳。