DNA文库的构建(精)

七、目的基因的克隆
基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基因组
中分离克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调 控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济
价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要
的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，
包括人体基因治疗。
目的基因的克隆战略：
步骤： 1）基因组DNA的酶切、固定 2）基因组DNA变性成单链 3）分离纯化cDNA文库的混合质粒 4）文库DNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固 定相应的cDNA, 5) 洗脱cDNA并重新转化受体菌。

限制：由于基因组的复杂性，很难获得覆盖基因组的 单链DNA 片段，导致文库内基因的丢失。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
3)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链
第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环
3、菌落原位杂交法
探针： 1）同源DNA探针 邻近种属的相应基因 2）根据氨基酸序列设计简并 探针
4、免疫筛选
需制备目的基因产物的抗体进行筛选。
五、克隆基因的验证和分析

限制性核酸内切酶分析 Southern杂交 体外表达蛋白 DNA序列分析，最准确和可靠的鉴定方法
六、DNA文库的保存
cDNA重组子
6、cDNA文库的载体选择
一般cDNA的长度范围多在0.5-8kb之间， 因此不用考虑外源片段的长度。 质粒载体或噬菌体载体
7、cDNA文库的均一化处理
均一化cDNA文库：是指某一特定组织或细胞的
所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表 达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。
合成第二链cDNA
S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成cDNA第二链
常用方法
PCR合成法是构建cDNA文库的一种新策略， 已得到广泛应用。优点：
1）它是以cDNA的第一条链为模板，设计并合成一组 引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA,由于其 放大的高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限的 生物材料构建cDNA文库，特别适合低拷贝mRNA 的克隆。 2）同时，可用总mRNA作为合成cDNA第一链的模板， 不用纯化mRNA，所以避免了纯化过程中某些信息 分子的丢失。 3）PCR合成cDNA第二链是通过在第一链3’端同聚物 加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核 苷酸，所以容易得到完整的cDNA。
分离polyA mRNA 寡聚dT, 构建cDNA文库 32P-dNTP
32P标记的cDNA探针
从原平板克隆 中分离cDNA

4、双链cDNA的分级分离
连接前回收大于500bp的cDNA用于连接。去掉 引物、街头及反转录产生的各种不完整的cDNA链， 提高文库质量。
5、双链cDNA与载体连接
1）同聚物加尾： 2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的 接头是最常用的方法 3）cDNA的定向插入：cDNA两端添加不同的限制性酶 切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接
1、表型筛选： 在宿主菌中表达目的基因，使宿主产生新的 表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的 基因。
(1)抗药性筛选:
这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。
(2)插入失活筛选法
(3)显色反应选择法(α-互补法)
将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和 氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化 至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的 宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融 为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的 宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖 苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基 上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。
1、构建感兴趣生物个体的基因组文库（鸟枪法 克隆目的基因、cDNA法克隆目的基因） 2、利用PCR扩增 3、化学合成
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大；不能除去真核生物目的基因的内含子结构
鸟枪法操作的改进
在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于 1.8 kb的SalI片段中，将染色
均一化 cDNA 文库是克服由于基因转录水平 上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措 施，有利于研究基因的表达和序列分析。
构建均一化cDNA文库主要有两种途径： 基因组DNA饱和杂交法 基于复性动力学原理的均一化学法
基因组DNA饱和杂交法

理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷 贝数相对一致。
一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。
（四）、亚基因组文库
指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交 显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上 则可将Spel酶切的 基因组DNA中的 8.3kb片断回收，用 于构建DNA文库。
第八章 DNA文库的构建
教学目的
掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA文库构建的基本原理和操作技术； 熟悉：cDNA 第一链的合成、cDNA 第二链的合
成；
一、基因文库
某一生物全部基因的集合 叫该生物的基因文库。 某一生物部分基因的集合叫 该生物的亚基因组文库。
基因文库（gene library)： 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载 体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 外源DNA片断、载体、宿主
基于复性动力学原理的均一化方法
理论基础：复性动力学原理 cDNA文库中高丰度cDNA复性所需时间较短，低丰度 cDNA复性所需时间较长，通过控制复性时间可使高丰 度的cDNA复性成双链状态，而低丰度cDNA仍保持单 链状态，分离单链cDNA，转化宿主细胞，即可得到均 一化cDNA文库。
四、基因克隆的筛选策略
（二）文库的代表性和随机性
文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可 以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任 何一段基因组DNA。
一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark和Carbon公式： N=ln（1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小 的比值

1．基因组 DNA 文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。

2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量 要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库 最终平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片 段越大。
同聚物加尾法：
末端转移酶+dCTP
末端转移酶+dGTP
载体和cDNA退火
CH3
CH3
加接头
CH3
接头
CH3
CH3
CH3
cDNA的定向插入
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
NotI Leabharlann Baidurimer/adaptor
SalI adaptor
3．文库的连接转化或包装侵染


寻找最适的载体与基因组之间的比例。 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价 高且质量稳定的包装蛋白， 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入 片段的 DNA 的转化效率也有所不同。

4．文库的质量检测
克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度 越高，文库质量就越好。
基因文库
cDNA文库
基因组文库与cDNA文库最大的区别在于cDNA文库具 有时空特异性。
基因文库的应用：
构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因
二、基因组DNA文库的构建
（一）基因组DNA文库的类型
质粒文库， （﹤10kb) 噬菌体文库，（0-23kb ) 粘粒文库， (~45kb) 人工染色体文库，(又称大片段基因组DNA文库， 100kb—1Mb）
三、cDNA文库的构建
1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材， 构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。
根
叶
花
花药
茎 穗下节 幼胚
GAmyb
2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29%
构建基因文库的基本程序： （1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA 片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA， （2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA， （3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌， （4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。

基因组DNA文库
2、均一化cDNA文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立 cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度 基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等 丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致， 这种cDNA文库称均一化cDNA文库。

3、cDNA文库的构建
第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体 并导入宿主中繁殖。
体DNA用SalI切开，琼脂糖凝
胶电泳分离，用刀片切下相当 于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝 胶块，从此凝胶块中回收DNA 片段，然后与载体进行拼接。
2.0 kb
1.6 kb
1.8 kb
cDNA法
处理材料 分离polyA mRNA 寡聚dT, 32P-dNTP 32P标记的cDNA探针 杂交，显影 对照材料
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99% 平均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb N=ln（1-p）/ln（1-f） =690773.2
（三）、基因组DNA文库的构建流程
基因组 DNA 文库的构建程序包含 5 个部分：



① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。 如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条 带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。 mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。

根据载体选择保存文库的方法 文库阵列法（无菌培养板）保存大片段DNA文库 长期保存需在-80℃下进行 避免文库的反复冻溶
基因组DNA文库与cDNA文库的比较



1）cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 2）cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信 息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外 大量调控序列的结构与功能方面信息。 3）在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克 隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因 此分离也就比较困难。