反相色谱法

三、色谱柱的再生 色谱柱在使用一段时间后柱效会下降，这 时可以考虑对色谱柱进行再生。 进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵， 我们建议：最好不使用您的高效液相色谱仪 上的泵。 建议用来冲洗的溶剂体积 色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 125*4mm 1.6ml 30ml 250*4mm 3.2ml 60ml 250*10mm 20ml 400ml
(4)Reversed-phase HPLC most common (high polarity solvent, high polarity solutes elute first) R is C8 or C18 hydrocarbon
(4) Stationary Phase Choice Choose column with similar polarity to analyte for maximum interaction Reversed-phase column (nonpolar) R hydrocarbon
一、平衡色谱柱 1.反相色谱柱
经过出厂测试后保存在乙腈/水中。 在用流动相分析样品之前，应使用10~20倍 柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱； 如果所使用的流动相中含有缓冲盐，应注 意用纯水“过渡”。
2. 硅胶柱或极性色谱柱
经过出厂测试后保存在正庚烷中。 如果该色谱柱需要使用含水的流动相，在使 用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡。
in a mixture P'AB = φAP'A + φ BP'B

fraction in mixture
In HPLC, capacity factor k' can be manipulated by changing solvent composition best resolution/time when k' = 2-5
二、如何平衡色谱柱？
新色谱柱，应首先用0.2ml/min的流速将色谱 柱平衡过夜，然后将流速升高到1.0ml/min冲洗 30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳 状态。这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且 保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓 冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的 时间来平衡)
5.正相色谱与反相色谱法比较
(1) Normal phase HPLC nonpolar solvent /polar column (2) Reversed phase HPLC polar solvent /nonpolar column
(3) Normal- (polar column) versus Reversed Phase (nonpolar) elution:
HPLC日常维护（二）
——色谱柱的Байду номын сангаас用和维护
每天用足够的时间来平衡色谱柱，会在处理 问题方面获得最大的“补偿”， 而且色谱柱的寿命也会变得更长！
一定得做！
新的色谱柱在使用之前进行性能测试，即使 用色谱柱附带的检验报告上的测试条件和样 品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的 使用中，应时常对色谱柱进行测试。
三、正相色谱法 Normal phase HPLC
正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品 中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正 相色谱法适于分析极性化合物。 氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极 性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于 可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。 氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其 选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖 类物质。
注意：由于气相色谱更快、更灵敏、更方便而 且耗费低，因此凡是能用气相色谱法分析的样 品一般不用液相色谱法。
二、高效液相色谱法的类型
高效液相色谱法可以分为： 液液分配色谱法（LLPC） 液固吸附色谱法(LSAC) 离子交换色谱法（IEC） 离子对色谱法（IPC） 离子色谱法（IC） 空间排阻色谱法（SEC） 亲和色谱法（AC）
③运行环境：
气相色谱法一般都在较高温度下进行分离和 测定，使其应用范围受到了较大的限制。
高效液相色谱一般在室温下进行分离和分析， 适于分离分析生物大分子、离子型化合物、不 稳定的天然产物和各种高分子化合物如：蛋白 质、氨基酸、核酸、多糖类、植物色素、高聚 物、染料、药物等。
④HPLC除用于分离和分析外，还可用于制备
Normal-phase column (polar)
R cyano (C2H4CN) 氰基柱
diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) amino (C3H6NH2) 氨基柱
most polar
least polar
(5)Mobile Phase Choice Polar ("strong") solvent interacts most with polar analyte (solute) –elutes faster but less resolution Strength characterized by polarity index P' ranges from -2 (nonpolar) to 10.2 (highly polar)
五、色谱柱的维护 1. 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/ 离子性流动相中有一定的溶解度） 2. 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~7.5， 尽量不超过该色谱柱的pH范围 3. 避免流动相组成及极性的剧烈变化 4. 流动相使用前必须经脱气和过滤处理 5. 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动 相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存 在乙腈中 6. 压力升高是需要更换预柱的信号
高效液相色谱法(HPLC)基本原理 一、高效液相色谱法与气相色谱法比较
① 分析对象：
气相色谱法只能分析气体和沸点较低的化合
物；
沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的有机 物，主要采用高效液相色谱法进行分离和分 析
② 流动相作用： 气相色谱法的流动相是惰性气体，仅起运载 作用 高效液相色谱法中流动相不仅起运载作用， 还与固定相一起共同完成对组分的分离
再生方法： 1.极性固定相的再生： 正庚烷 氯仿 乙酸乙酯
丙酮
乙醇
水
2.非极性固定相的再生： 水 乙腈 氯仿(或异丙醇) 乙腈 水
3. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
四、注意： 1.在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于 NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该 在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲 洗至碱溶液完全流出。 2.如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完 全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M的硫 酸冲洗非常有效。
总之，正相键合相色谱法适于分析中等极性 的化合物如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳 香胺、脂和有机氯农药等。
四、反相色谱法 Reversed phase HPLC
反相色谱法的流动相极性大于固定相，极性 大的组分先流出色谱柱，极性小者后流出，适 于分析非极性化合物。 现用得最多的是反相键合相色谱法。典型的 反相键合相色谱是在ODS柱上，采用甲醇－水 或乙腈－水作流动相，分离非极性或中等极性 的化合物如同系物、绸环芳烃、药物、激素、 天然产物及农药残留等。