目的基因的获取优秀课件

二、基因组文库的构建
1. 基因组文库
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合 适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连 接，引入相应的宿主细胞中繁殖保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因
筛选目的基因
2. 载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整 的基因文库所需要的重组子的数目。
目的基因的获取优秀 课件
生物种类 人
拟南芥 果蝇 水稻 蠕虫 流感病毒
基因数目（万个） 3~4 2.55 1.36 5 1.78 0.175
单个gene在整个基因组中所占的比例极 其微小，加上复杂的基因间序列；对单 个目的gene的分离如同大海捞针。
已知基因的获取方法： ⒈PCR技术扩增目的基因 ⒉化学方法人工合成目的基因
5’- GATC-3’ 5’-G GATC-3’
第三节 目的基因的保存和扩增
一、基因文库（gene library）
1. 基因文库
文库：是指一种全体的集合。 通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、
组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克 隆集合体。
克隆并不是为了保存，而是为了分离。
为什么要建基因文库？
如：Sau3A与BamHI的酶切末端。 ②人工接头法
人工合成的限制性内切酶粘性末端片断
各种酶的接头可以向公司定做或购买
接上人工接头
③ 同聚物加尾
粘性末端
末端转移酶
CCC
CCC
粘性末端
4. 基因组文库的大小
一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目
基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：
限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
影响所切出的产物的长度和随机程度
1）4bp的内切酶
平均每256（ 44 ）bp一个切点 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI
2）6bp的内切酶
平均每4096 （ 46 ）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连
Sau3AI BamH I
N=
ln (1-p) ln (1-f)
p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）
f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数
N:所需的重组载体数（克隆数）
N=
ln (1-p) ln (1-f)
=
ln (1-99%) ln (1-f)
未知基因的获得途径：
⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因 2.构建cDNA文库，筛选目的基因 3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 4.酵母双杂交体内鉴定基因
本章内容
第一节 基因组DNA的片断化 第二节 基因的化学合成 第三节 目的基因的保存和扩增 第四节 目的基因的分离和扩增
第一节 基因组DNA的片断化
cDNA文库：mRNA反转录成的cDNA。 如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基 酸序列，可以根据克隆的cDNA分子的核苷 酸序列推导出来。
mRNA结构图 DNA结构图
2. 基因文库的构建
载体的制备 DNA的提取及片段化、cDNA的合成
载体与插入片段的连接 重组DNA分子导入宿主菌
转化细胞的筛选
适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNA文库、线 粒体DNA文库、cDNA文库。
3. 基因组文库构建的一般步骤
（1）基因组DNA的提取
关键:制备高分子质量的基因组DNA 在提取时必须尽可能地避免机械切割
经典的方法： 在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化细胞，然 后用酚－氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去 除分子质量杂质。
2. 缺点 ①目的基因内部可能有内切酶的切点
BamH I BamH I
BamH I
Gene 目的基因也被切成碎片！
②消化的片断分子量太大或太小 不符合载体容量，不能克隆 解决的办法
采用随机片断化制备DNA的克隆片断
3. 限制性内切酶局部消化法
控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶 切位点只有一部分被随机切开。
对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少
目前常用的载体
载体系列：容量为24kp cosmid载体：容量为50kb YAC：容量为1Mb BAC: 容量为 300kb
（1）λ噬菌体载体
最常用
插入型载体构建文库时，通常用限制性核酸内切 酶切割位于λ噬菌体DNA非必需区的单一酶切位点， 以供外源基因片段的插入，插入片段适宜长度约 为9kb。 替代型载体构建文库时，需要将非必需区两边 的臂进行分析纯化，才能用于连接，插入片段 适宜长度约为9～22kb。
一、 机械切割法 二、限制性内切酶消化法
一. 机械切割法 （1）超声波 断裂成约300bp的随机片断 （2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断
（3）移液器抽吸法
二、限制性内切酶消化法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。
酶切
基因组DNA
1. 优点
如果带有粘性末端，产物可以 直接与载体连接，连接效率高
高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基 因在基因组或某个特定发育阶段或特定组 织中所占比例很小。因此，要想从庞大的 基因组中分离某个特定的未知基因非常难 的，必须构建基因文库，利用文库筛选技 术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行 分析。
基因文库的分类
基因组文库：提取染色体基因组DNA。如 果要研究的是控制基因表达的调控序列， 或是在mRNA中不存在的某种特定序列。
（2）DNA克隆片段的制备 关键：断点完全随机，片断长度合适于载体连接
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）
② 酶切法：
内切酶Sau3A进行局部消化。 可得到10-30kb的随机片断
（3）载体与基因组DNA大片段的连接
直接连接、人工接头或同聚物加尾
① 粘性末端直接连接
载体与外源DNA大片段的两个末端都有 相同的粘性末端。
（2）黏粒载体wk.baidu.com
不仅能克隆和增殖完整的真核基因，还可克隆和分 析组成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。
构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。
（3）YAC、BAC载体
克隆大片断DNA的载体。 可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划 中，YAC被广泛地用于大规模基因组结构分析。
（4）质粒载体
最早用于基因克隆的载体。 只能容纳比质粒分子量更小的片段。 不能用于核基因组文库。