日本某公司液相色谱基础知识(ppt 56页)

ratio 280/220
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波长扫描
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二极管阵列检测器（SPD－M10AVP）
二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器 紫外光谱 二极管阵列检测器
系统简单 需在线脱气机 存在时间滞后效应
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进样器
自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
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手动进样器的原理图
A 进样器
A泵
B 浓度
B
B泵
色谱柱 柱温箱
时间
检测器
等度洗脱
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
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( column : ODS type )
梯度洗脱
95%
30%
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浓 度
MeO H
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度
注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测 器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流 动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
缺点
需要更换柱塞杆密封圈
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岛津VP系列输液泵
目的
单元 流速范围
特性和应用
分析
LC-10ADVP LC-10ATVP
0.001-9.999 无脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS
0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析

液相色谱基础知识

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石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
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液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析
色谱柱 柱温箱
检测器 数据处理
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流动相
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溶剂等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光
去离子水
率 纯化水
波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
波长
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NEXT
波长切换
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双波长检测
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比例色谱
280nm
220 nm
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样品过滤头的类型：
30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有 纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤 维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格。处理 样品体积为7µl。
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流动相注意点
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LC检测器
紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）
*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度
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等度洗脱
输液泵 进样器
柱温箱 色谱柱
检测器
单一或混合溶剂
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梯度洗脱
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输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制
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柱塞往复泵
马达和凸轮
泵头
柱塞杆 柱塞杆密封圈
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单向阀 10 -100uL
柱塞往复泵
优点
压力脉动小 易于更换溶剂
分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性
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色谱柱
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相PH使用范围为2～7.5
溶剂等级
分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图
甲醇
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乙睛
正己烷
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱 柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
过滤膜种类 水系过滤膜 有机系过滤膜
紫外可见检测器
光栅
l
样品池
Ein
Eout
光电管
D2 / W 灯
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Ein
Ein
参比池
光电管
岛津VP系列紫外检测器功能
1）设定时间程序（波长切换等） 2）双波长检测 3）比例色谱，初步判断峰的纯度 4）停泵扫描，确定组分最大吸收
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溶剂前处理
脱气
目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气
泡
一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个
溶剂所能容纳的空气总量要小
气泡对测定的影响：
1）柱压波动，流量偏小
2）基线波动
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高压/低压梯度系统
高压梯度
低压梯度
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混合器
低压梯度比例阀
脱气机
高压/低压梯度系统
高压梯度系统
梯度准确度好 系统复杂 (需两台或三台泵)
低压梯度系统
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
Si
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modified Si
反相HPLC色谱柱
C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type
鬼峰
溶剂等级
溶剂的等级
HPLC级 优级纯 分析纯
微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒) 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂
HPLC级经过0.22um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
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T1
1/2 1/3
Initial detection point
T3
Final detection point
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滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质 和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
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流路中形成气泡引起的问题
改变保留时间和峰面积
流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动
峰变形
柱中气泡形成和累积使流动相绕流
尖峰或锯齿状噪声
检测池中气泡形成和累积产生基线噪声
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输液泵
输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵
Non-polar property -Si-C18H37
Si
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反相色谱
色谱柱 : 非极性
溶剂 : 极性
水 / 甲醇 / 乙腈
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液相色谱流程图
进样器 输液泵 溶剂
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紫外可见检测器
紫外可见检测器 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择
性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感
2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
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纯化水中去除了无机和有机的污染物
溶剂等级
鬼峰的出现
水 / MeOH梯度
ODS 柱
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1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.
流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 流动相只起运载样品分子的能力
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
HPLC的分离类型
正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode)
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装填状态
进样状态 返回
进样体积与响应值关系
检 测 器 响 部分注入 应 值
定量管体积的一半
全量注入 3倍定量管体积
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进样体积 返回
柱温箱
柱温控制的优点：
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二极管阵列检测器
样品池 D2 / W灯
光栅
每一单元可检测一个 波长下的吸光度
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二极管阵列（512个单元）
三维谱图
吸 光 度
光谱
色谱
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正相HPLC色谱柱
硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析
Si
Silica gel
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时间
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索
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峰纯度检验（3点光谱图比较）
T2 up slope
peak top down slope
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