植物生理相关指标测定方法

可溶性糖含量测定

1，试剂配制

1) 葡萄糖标液100μg/ml ：10mg/100ml;

2) 蒽酮试剂：200mg蒽酮溶于100ml98%硫酸溶液中，用时现配2 ，标准曲线

a) 加盖振荡5min（涡旋5min）

b) 之后立即将其放入沸水浴中保温7min

c) 取出自然冷却至室温，测620nm处吸光度

3 ，样品测定

a) 称取样品0.1g，剪成 1cm 小段，加 10ml 水沸水浴 1h，自然冷

却后，定至10ml；

b）加提取液0.2ml ①

蒸馏水 0.8ml②

蒽酮试剂 4ml③

C）后续操作和标曲操作一样，测OD值

4 计算

可溶性糖含量=X*V T*(W F*V S)-1

X——测定的值（ug/ml）

V T——提取液体积（ml）

V S——测定时吸取的体积（ml）

W F——称取样品鲜重（g）

一、试剂配制

1) 50mM Na-phosphate 缓冲液 PH7.0 （PBS7.0）

母液 A（0.2M NaH2PO4·2H2O）31.2g/L （蒸馏水定容）

母液 B（0.2M Na2HPO4·12H2O） 71.628g/L （蒸馏水定容）

97.5ml A + 152.5ml B 蒸馏水定容至 1000ml

195ml A + 305ml B 蒸馏水定容至 2000ml

2) 50mM Na-phosphate PH7.8 （PBS7.8）

21.25ml A + 228.75ml B 蒸馏水定容至 1000ml

42.5ml A + 457.5ml B 蒸馏水定容至 2000ml

3) 10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容

4) 酶提取液：

100ml PBS7.0 + 1g PVP + 0.00744g EDTANa

1000ml PBS7.0 + 10g PVP + 0.0744g EDTANa

5) 硼酸-硼砂缓冲液：

母液A(0.05mol/L硼砂溶液)：称19.07gNa2B4O7.10H2O(M=381.43)溶解稀释至1000ml，硼砂易失水，必须在带塞得瓶中保存。9.535g定容于500ml。

母液B(0.2mol/L硼酸溶液)：称取12.37gH2BO3(M=61.84)溶解，稀释至1000ml，6.185g定容于500ml。

二、酶液的提取

（2ml 的离心管）

1，称样0.15g，剪碎与研钵中；

2，加适量液氮，研磨成粉末状

3，加1ml 酶提取液，研磨成匀浆，转移到2ml 的离心管中；

4，加 1ml 酶提取液冲洗，转移至之前的离心管中，标号，存于冰盒中；

5，4℃，15000*g离心，20min；

6，上清转移至新的 2ml 的离心管中4℃保存备用，转移到新管的目的是为了将上清混匀，进行样品测定。

如需长期保存，需放入-80℃冰箱保存

三、可溶性蛋白测定（10ml离心管）

2，测样

a 取酶液 50ul，加蒸馏水950ul。

b 加5ml 考马斯亮蓝后，混匀，静置5min，595nm比色。

3，计算样品中蛋白质的质量分数（mg/g）=(C*V T)*(1000*V S*W F)-1 C——查标准曲线值（ug）

V T——提取液总体积（ml）

W F——样品鲜重（g）

V S——测定时加样量（ml）

4，试剂配制

牛血清蛋白标液（100μg/m l）：牛血清蛋白 10mg用质量分数为0.9%的氯化钠溶解，并定容于100ml

考马斯亮蓝溶液（G250）：100mg考马斯亮蓝250，溶于 50ml 90%的乙醇，加 100ml 85% 磷酸，蒸馏水定容至 1000ml，两层滤纸过滤，室温下可放置1-2 个月

四、过氧化物酶POD活性（茶褐色产物）

（4ml离心管）

1，加样①50Mm PBS7.0 1ml

②0.3% H2O21ml

③0.2% 愈创木酚 0.95ml

④酶液（对照PBS） 50ul

2,加盖混匀，加样96孔板

3,室温反应，470nm处测OD值，动力学测，10min，每2min测一次

4,以每分钟内OD值变化0.01为一个酶活力单位U.

5，计算

POD酶活性= （ΔOD470*V T）*(0.01*W F*V S*t)-1

ΔOD470——反应时间内吸光值的变化

W F——样品鲜重（g）

t——反应时间（min）

V T——提取粗酶液总体积（ml）

V S——测定时取用的酶液体积（ml）

6,试剂配制

0.3% H2O2：1ml 30% H2O2，蒸馏水至100ml，避光保存

0.2%愈创木酚：0.2g，少量乙醇（5ml）溶解，蒸馏水定容至100ml

200μl，20ml 95%乙醇，蒸馏水定容100ml

五、超氧化物歧化酶SOD活性测定

（4ml体系）

两只对照管，暗处理的离心管提前用锡箔纸包好

1，加样①PBS7.8 2.82ml

②13mM Met甲硫氨酸 30ul

③10Mm EDTA 30ul

④6.3Mm NBT 30ul

⑤酶液（对照PBS） 60ul

⑥核黄素（最后加） 30ul

2，加盖混匀，暗处理的离心管用锡箔纸包好头。一起放在组培室，25℃，光照。处理20min。

3，反应结束，暗条件下，快速加样96孔板。

4，放于酶标仪，于560nm波长，测OD值

5，计算以遮光的对照管作为空白，调零。以能抑制反应50%的酶量为1个SOD酶单位，用U表示。

SOD活性=(A0-A S)*V T*(0.5*A0*W F*V s)-1

A0——照光对照管的OD值

A S——样品管的 OD值

V T——样品的总体积（ml）

V s——测定时样品用量（ml）

W F——样品的鲜重（g）

7，试剂配制

0.05mmol/L PBS7.8

13mM 甲硫氨酸：0.194g/100ml；0.485g/250ml；0.97g/500ml；PBS7.8 定容

6.3mM NBT：0.05256g/10ml；0.5256g/100ml；PBS

7.8 定容；避光保存

10mM EDTANa2：0.372g/100ml PBS7.8 定容

130μM核黄素：0.00499g/100ml，少量稀碱溶解，蒸馏水定容，避光，现用现配