高中生物选修一教案：课题1 dna的粗提取与鉴定

课题1DNA的粗提取与鉴定

教材内容解读

要点1提取DNA的方法

（1）分离

选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

（2）DNA的溶解性

DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl的浓度变化，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。选择适当的盐溶液就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA会析出。

DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA 与蛋白质进一步分离。

（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性

蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

（4）DNA的鉴定

在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。要点2实验设计

（1）实验材料的选取

选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血。

（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液

动物细胞以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。

植物细胞需要先用洗涤剂溶解细胞膜。

（3）去除滤液中的杂质

方法有三种：

①在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。

②直接在滤液中加入嫩肉粉反应10～15分钟，嫩肉粉中的木瓜蛋白质酶能够分解蛋白质。

③将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15分钟。

（4）DNA的析出与鉴定

①析出较纯净的DNA

将处理后的溶液过滤，加入与溶液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3分钟，溶液中会出现白色丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。

②DNA的鉴定

取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5分钟，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。溶解有DNA的溶液变蓝。

要点3实验案例

案例一以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取

课前准备

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

教师可以到市场售活鸡处索取鸡血，所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约180mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心，用2000r/min或3000r/min的转速，离心2min，使血细胞沉淀于离心管底部，这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

提取DNA的具体步骤

1.破碎细胞，释放DNA

鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般5～10mL的鸡血细胞液加入20mL蒸馏水搅拌5min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。

2．溶解细胞核内的DNA

在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。

3．DNA的析出

将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA 的三种方案，本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.1～0.2mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。

用3～4层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4000r/min转速的离心机，离心15min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。

4.DNA的初步纯化

如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯，下面的方案可供参考。

将DNA黏稠物再溶解，继续用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤（或离心），滤