肾衰实验

肾脏的泌尿功能与急性肾功能不全

一、实验目的

1.观察神经体液等因素对尿生成的影响。

2.学习急性中毒性肾功能不全动物模型的复制。

3.了解中毒家兔肾功能的改变，并分析导致急性肾功能不全的发病机制。

4.观察利尿剂对急性肾功能不全的治疗效果，并分析药物作用机制。

二、实验原理

㈠肾脏的功能

正常的肾功能主要是泌尿，通过泌尿排出代谢废物，并维持水、电解质和酸碱平衡，保持机体内环境的稳定；红细胞生成素、1,25-二羟维生素D3等物质；并使某些激素，如胃泌素、甲状旁腺激素在肾内灭活，因而又与机体许多功能代谢活动密切相关。

㈡影响尿生成的因素

尿生成的过程包括肾小球的滤过、肾小管和集合管的重吸收及分泌三个环节，凡能影响上述过程的因素，都可能影响尿的生成，从而引起尿量的变化。

1．影响肾小球滤过的因素

⑴滤过分数即滤过膜的面积和通透性。

⑵有效滤过压其中肾小球毛细血管血压是经常变动的因素。

⑶肾血流量的变化受肾自身调节和神经体液调节，主要影响滤过平衡的位置。

2．肾小管和集合管的重吸收及分泌的调节

⑴肾内自身调节

①小管液中溶质的浓度临床上常用的利尿方式－渗透性利尿。

②球-管平衡近端小管定比重吸收Na＋、H2O约65％～70％，那么，尿中排出的溶质和水不致因肾小管滤过率的增减而出现大幅度的变动。

⑵神经因素

当肾交感神经兴奋时，作用于入球小动脉、出球小动脉，入球小动脉口径缩小更为明显，肾小球毛细血管血流量减少，毛细血管血压下降，那么，有效滤过压降低，肾小球滤过率降低；还激活RAAS，增加肾小管重吸收NaCl、H2O；直接增加近端小管、髓袢上皮细胞重吸收Na＋、Cl－、H2O。

⑶体液因素

①抗利尿激素提高远曲小管和集合管上皮细胞对水的通透性；也增加髓袢升支粗段对NaCl的主动重吸收和内髓部集合管对尿素的通透性。由于抗利尿激素主要感受血浆晶体渗透压、循环血量和动脉血压，因此，水的利尿效果较生理盐水好。

②肾素-血管紧张素-醛固酮系统

血管紧张素Ⅱ的作用为：刺激醛固酮的合成，调节远曲小管、集合管Na＋、K+的转运；刺激近端小管重吸收NaCl；刺激抗利尿激素的分泌。

醛固酮可促进远曲小管和集合管主细胞重吸收Na＋，排出K+。

③心房钠尿肽作用于集合管使NaCl重吸收减少；舒张入球小动脉、出球小动脉，使肾小球毛细血管血流量增加，肾小球滤过率升高；还可抑制肾素、血管紧张素、抗利尿激素的分泌。

㈢急性肾功能不全

由于肾脏的泌尿功能障碍，即肾小球滤过率急剧减少，或肾小管发生变性、坏死而引起的一种严重的急性病理过程，往往出现少尿（有些不明显，或增多）以及随之而产生的氮质血症、高钾血症、代谢性酸中毒和水中毒等综合症。

引起急性肾功能不全的主要原因：

①肾前性凡能使有效循环血量减少，心输出量下降以及引起肾血管收缩的因素，均可导致肾灌流不足，肾小球滤过率下降，最终发生急性肾功能不全，如心衰、休克。

②肾性肾本身的一些器质性病变和肾毒物引起的急性肾小管坏死，如肾炎、红斑狼疮、重金属盐、有机溶媒中毒。

③肾后性从肾盂到尿道的尿路急性梗阻，如结石、肿瘤。

肾性肾功能不全的临床特点：临床分为少尿型和非少尿型两种，前者多见。少尿型一般出现少尿甚至无尿，非少尿型尿量可大于500ml/d。由于肾小管有器质性损伤失去了浓缩和稀释功能，尿比重可大于1.010称为等渗尿，同时也失去了重吸收钠的能力，尿钠浓度高（﹥40mmol/L）,尿常规可发现血尿，镜检有多种细胞并有管型（色素管型、颗粒管型和细胞管型）。血液尿素氮（BUN：3.57-7.14mmol/L）和血浆肌酐进行性升高，肌酐与尿素从尿中排出障碍，尿肌酐/血肌酐﹤20，与功能性肾衰﹥40有明显区别。

㈣急性肾功能不全评价的病生指标

主要有内生肌酐清除率、尿肌酐/血肌酐比值、肾脏酚红排泄率、钠排泄分数等，今天实验要测定的有内生肌酐清除率、尿肌酐/血肌酐比值。

清除率是指两肾在单位时间内能将多少毫升血浆中的某物质完全清除出去，这个被完全清除的某物质的血浆毫升数，称为该物质的清除率。具体计算清除率时需要测定三个数值：尿中某物质的浓度（U mg/100ml），每分钟尿量（V ml/min）和血浆中某物质的浓度（P mg/100ml）。因为尿中该物质均来自血浆，所以，U×V=P×C,亦即C= U×V/P。

测定清除率不但可以了解肾的功能，还可以测定肾小球滤过率、肾血流量和推测肾小管转运功能。由于实验条件限制，我们主要测定肾小球滤过率（F）。

如果某物质可以自由滤过，既不被重吸收，也不被分泌，那么C=F= U ×V/P；而肌酐就与这类物质接近，因此，实际工作中我们常用内生肌酐清除率来反映肾小球及肾的功能状态。

三、实验对象家兔（体重在2Kg以上），2只/组。

四、实验器械和药品

器械哺乳类动物手术器械1套、注射器、试管、吸量管、7230分光光度计、水浴箱、离心机等

药品 1％HgCl2 、0.9％NaCl 、20％乌拉坦、1%呋塞米、 1/10000肾上腺素、20%葡萄糖、苦味酸、12.5%NaOH

五、实验步骤

1．复制动物模型

实验前一天，取两只家兔，称重，一只皮下或肌肉注射1％HgCl2（0.9ml/Kg体重）造成急性肾功能不全作为实验家兔；另一只皮下或肌肉注射等量的生理盐水（0.9ml/Kg体重）作为对照组兔。24h后，即实验前，我们要比较汞中毒家兔及正常家兔的一般状态。

2．抓取→称重→麻醉（20% 乌拉坦 5ml/kg）

右手抓住其颈部皮肤，轻轻提起，左手迅速托住其臀部。按kg读数。200/0氨基甲酸乙脂每公斤体重5ml，通过耳缘静脉注射，耳缘静脉位于耳背面外侧缘，拔去兔毛，用手轻弹或轻夹静脉使血管充盈、扩张，便于穿刺进针。左手拇指和无名指固定兔耳远心端，食指和中指捏住近心端，右手持注射器，针头斜面和针管上刻度一致，针尖以15－20度角刺入血管（尽量从远心端开始），当回抽有血或阻力小时，可推进注射器针管，注射速度不要过快，注射时注意观察深浅反射和呼吸（麻醉成功标志：夹趾反射完全消失）。细线挂其门牙固定头部，四肢夹于兔台四个兔夹上。

3．取血，测血肌酐

实验开始时，先从家兔心脏采血3～5ml（注意心脏穿刺不超过3次，

否则要从颈外静脉采血），置于一干净试管中，备测血肌酐。

按下表操作步骤测定血肌酐

把各试管混匀，37℃水浴30min，以510nm波长比色，空白管调零，读OD值，然后在各试管内滴加醋酸两滴，放置6min后，再测OD值。

〔Cr〕p计算：〔Cr〕p（mg%）＝（OD测－OD′测）×5/OD标其中OD标为加醋酸前标准管光密度。〔Cr〕P的正常值为0.7～0.8mg%。

4．颈外静脉插管

分离一侧颈外静脉并在其上剪一小口用于输液。注意静脉分离干净,插管要结扎牢固,静脉采血要在输液前。

5．暴露膀胱，取尿测尿肌酐

下腹部正中剪毛，在耻骨联合上约1cm处做长约4cm的切口，暴露膀胱,用注射器收集3ml尿液于试管中，备测尿肌酐。

按下表操作步骤测定尿肌酐

将各试管混匀，放置10min后，以530nm波长比色，空白管调零，读OD值。

〔Cr〕U计算：〔Cr〕U（mg%）＝OD测×50/OD标

根据公式Ccr＝〔Cr〕U×尿量（ml/min）/〔Cr〕p计算内生肌酐清除率以及〔Cr〕U/〔Cr〕p的计算。

6．分离输尿管，进行插管

在膀胱底部找出两侧输尿管并分离之。在近膀胱端结扎输尿管，稍等片刻，待其充盈后，用眼科剪做一切口，向肾脏方向插入一细塑料管，结扎并固定，用于收集尿液。注意首先要找准输尿管并分离干净，切口

约1/3～1/2输尿管口径，最后插管动作要轻柔。

7．对照组动物做影响尿生成因素的观察

⑴先记录5min的尿量作为对照，然后再开始。

⑵耳缘静脉注射37℃的生理盐水20ml，记录尿量5min。用水浴箱

加热生理盐水至37℃。

⑶耳缘静脉注射20%葡萄糖5ml，记录尿量5min。

⑷耳缘静脉注射1/万肾上腺素0.3ml，记录尿量5min。

⑸耳缘静脉注射1%呋塞米（1ml/Kg体重），记录尿量5min。

注意每次给药后稳定5min再记录尿量。

8．实验组家兔（急性肾功能不全）－治疗实验

先收集5min尿量，然后耳缘静脉注射1%呋塞米（1ml/Kg体重），观察给药后5min的尿量和30min的总尿量，与给药前进行比较。

9．肾形态学观察

处死家兔，取出肾脏，比较两组家兔肾脏外形；纵向剖开肾脏，观察皮髓质条纹、色泽等。

六、实验结果及分析

1．HgCl2引起急性肾功能不全的机制：

（1）肾缺血 HgCl2最易损伤近曲小管、髓袢升支粗段，使NaCl的重吸收减少，那么到达远曲小管内的NaCl增加，刺激致密斑使肾素分泌增加，肾素-血管紧张素系统激活，血管紧张素Ⅱ增加，从而使入球小动脉收缩，肾小球毛细血管血压下降，肾小球有效滤过压下降，肾小球滤过率下降，导致少尿。

（2）肾小管阻塞当HgCl2引起急性肾小管上皮细胞坏死时，管型、细胞碎片或细胞肿胀等阻塞肾小管，直接引起少尿；另一方面，近端肾小管阻塞，肾小囊内压升高，有效滤过压下降，肾小球滤过率降低，尿量减少。

（3）原尿回漏和肾间质水肿肾小管上皮细胞受损，基膜断裂，原尿到达肾小管时便回漏到肾间质，而后进入肾血管，直接使尿量减少。肾间质水肿和间质压增高，一方面使有效滤过压下降，导致肾小球滤过率降低，尿量减少；另一方面，压迫肾血管，妨碍尿液流入肾小管，压迫肾周围毛细血管，导致肾缺血，进一步引起少尿。

2．内生肌酐清除率（80～120ml/min）测定的临床意义：

（1）判断肾小球损害的敏感指标多数急性肾小球肾炎内生肌酐清除率低到正常值的80%以下，但血清尿素氮、肌酐测定仍在正常范围，故是较早的反映肾小球滤过功能的敏感指标。

（2）初步估价肾脏的损害程度轻度损害Ccr在70～51ml/min；中度损害在50～30ml/min；小于30ml/min为重度损害；慢性肾功能衰竭病人若清除率在20～11ml/min为早期肾功能衰竭；10～6ml/min为晚期肾功能衰竭；小于5ml/min为终末期肾功能衰竭。

（3）指导治疗内生肌酐清除率为30～40ml/min，应限制蛋白质摄入；小于30ml/min噻嗪类利尿剂治疗常无效；小于10ml/min应结合临床进行透析治疗，对袢利尿剂（如速尿、利尿酸钠）的反应也已极差。

（4）慢性肾炎临床分型的参考如慢性肾炎普通型Ccr常降低，肾病型Ccr常偏高。

3．尿肌酐/血肌酐比值：

功能性肾衰﹥40，器质性肾衰﹤20。功能性肾衰（也叫肾前性肾衰）由肾的灌流不足引起，使肾血流量和肾小球滤过率下降，但内生肌酐在体内积聚不多；器质性肾衰由肾小球滤过率下降、肾小管坏死引起，内生肌酐不能从尿中排出，从而使血肌酐浓度急剧升高。

4．注射生理盐水20ml：尿量增多，血压升高

①注射生理盐水20ml，血容量增加，左心房被扩张，刺激了容量感受器，传入冲动经迷走神经传入中枢，可抑制下丘脑-垂体后叶系统释放抗利尿激素，远曲小管、集合管对水重吸收减少，从而引起利尿。

②血容量增加，心输出量增加，引起动脉血压升高，刺激颈动脉窦压力感受器，反射性抑制抗利尿激素的释放，尿量增加。

③血容量增加，一方面引起血浆胶体渗透压降低，肾小球有效滤过压升高，尿量增加；另一方面，心输出量增加，肾血液灌流增加，肾小球毛细血管血压升高，引起肾小球有效滤过压升高，尿量增多。

5．注射20%葡萄糖5ml：尿量增多，血压无明显变化

原尿中的葡萄糖浓度＝血糖浓度，但终尿不含葡萄糖，因为葡萄糖在近曲小管被全部重吸收。由于肾小管对葡萄糖的吸收有一定的限度，当葡萄糖的滤过量达到220mg/min时（血糖为180mg/100ml），尿中开始出现葡萄糖，此时的血糖浓度称为肾糖阈。当血糖浓度再最大时，小管液中的葡萄糖浓度也增大，使近端小管液的渗透压增大，水重吸收减少，小管液中的Na＋浓度与细胞内的Na＋浓度接近，Na＋重吸收减少，尿量增加。

6．注射1/10000肾上腺素：尿量减少，血压升高

入球小动脉是出球小动脉直径的2倍，肾上腺素与肾血管平滑肌α受体结合，血管收缩，其中入球小动脉管径收缩更明显，入球小动脉血流量减少，肾小球毛细血管血压下降，有效滤过压降低，肾小球滤过率降低，

使尿量减少。

7．注射1%呋塞米（1ml/Kg体重）：尿量增加

呋塞米特异性地与Cl－竞争Na＋- K+ -2Cl－共同转运载体蛋白的Cl－结合部位，NaCl重吸收受抑制，髓质的高渗梯度被破坏，水重吸收被抑制，尿量增加。

8．速尿治疗急性肾功能不全的机制：

①可减少超滤液在肾小管的重吸收，有助于清除阻塞肾小管的色素、蛋白管型及细胞碎片。

②有助于解除微动脉的持续收缩，因为速尿也属于血管扩张剂。

③克服无再流现象，高渗可减轻毛细血管内皮细胞肿胀。

④降低缺血肾引起的肾素分泌。

⑤清除羟自由基，非特异性地保护肾功能，并降低血液粘滞度。

9．肾形态观察：

（1）正常家兔表面光滑，皮质红褐色，髓质淡红色，皮髓质纹理清楚。

（2）中毒家兔重量增加，体积增大，包膜紧张，皮质肿胀苍白，纹理不清，髓质充血。

七、注意事项

1．麻醉的速度、剂量及随时检查深浅反射。

2．手术的创口不宜过大，以防体温下降影响实验。

3．找准输尿管，分离要干净，切口不宜过大，插管动作要轻柔。

4．各试管要区分清楚，加样要准确。

5．仪器要正确操作使用。