淋巴细胞培养技术

一、苜蓿多糖对淋巴细胞的影响

1 材料与试剂

1.1动物

小白鼠

1.2材料

苜蓿多糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、96孔细胞培养板、四甲基偶氮唑盐（MTT）、台盼蓝、尼龙毛、

1.3试剂配制

1.3.1 RPMI-1640培养基配制

100 U/mL 青霉素、125 µg/mL 链霉素

将RPMI-1640干粉袋中的粉末用力往下甩，开口倒出粉末，量取800mL的三蒸水，先冲洗袋子至干净，然后加入2 g NaHCO3，搅拌定容至1000 mL，调pH值为7.1-7.3。过滤除菌，放于-20ºC 储存。

1.3.2 胎牛血清

将冷藏的胎牛血清放在4°C，使之融化一半，然后室温放置使其完全融化。56°C水浴30 min 将其灭活，分装到15 mL的离心管中，-20℃保存备用。

1.3.3 pH7.2 PBS 缓冲液

准确称取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.925g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，用三蒸水溶解，然后用HCl（1 mol/L）调pH值至7.2，加水定容至1000 mL，120°C高压灭菌，4°C保存备用。

1.3.4 红细胞裂解液

称取NH4Cl 4.16 g，KHCO3 0.5g，Na2EDTA 0.02g，溶于100 mL蒸馏水中，调pH 7.2，加水至500mL，存于4ºC。

1.3.5 MTT作用液

称取50 mg MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。），溶解在10 mL PBS 中，0.22 μm的滤器过滤除菌，4℃避光保存。（MTT有致癌性，用时需戴透明PE手套）

2（1）T、B淋巴细胞制备：

①颈椎脱臼法处死，用75%酒精消毒，浸泡1-2 min，在超净工作台中取出脾脏，用灭菌生理盐水冲洗3次，剔除脂肪和结缔组织，置于含D-Hanks（相当于生理盐水）无菌培养皿里，放入含D-Hanks液的平皿中用灭菌的剪刀、镊子把器官剪碎，在200目的细胞筛网上挤压研磨过滤，收集细胞悬液。将Percoll分层液1 mL加到10 mL试管中，缓慢贴壁把以上淋巴细胞悬液加到分层液上面，把试管用橡皮塞塞紧，以3000 r/min 离心15 min；后

用移液管吸出淋巴细胞，用完全RPMI-1640洗2次，倒出上清，再准确加 5 mL完全RPMI-1640培养液，用枪头吹吸使之混匀，计数板显微镜下计数；计数以后以1000 r/min 离心5 min；离心以后弃去上清液，加适量的完全RPMI-1640培养液将细胞调成2×107 个mL-1，并用台盼蓝染色检测细胞活力大于95%，即得到淋巴细胞培养液。

② T、B淋巴细胞的纯化[1]：

尼龙棉以0 .2 mol/L HCl浸泡6 h，再用大量蒸馏水反复冲洗，晾干。称取尼龙棉50 mg，将其仔细撕开装填入10 mL注射器内，高压灭菌。尼龙棉柱高度为6 cm，可有效地过滤（2~3）× 107个细胞。用D-Hanks 液和RPMI-1640（含10 % 胎牛血清）培养基洗柱各2次，以平衡pH、温度、排除空气，37°C放置1 h。上柱前，先将平衡液放出，垂直滴加入淋巴细胞悬液0.5 mL，平放尼龙棉柱，以细长的毛细滴管伸入柱内界面加入培养液0.5 mL封口，将柱于37°C静置孵育1 h，用预温的培养液淋洗柱2~3 次，流速控制在1 mL/ min ，收集最初的10 mL流出液，1300 r/min离心10 min，此即分离的纯化T 淋巴细胞。再用培养液边洗脱边挤压尼龙毛柱，用钢针缓缓从上至下挤压尼龙棉，使柱中细胞挤出，收集的洗脱液是B 淋巴细胞，1300 r/min离心10 min，此即分离的纯化B淋巴细胞。

③流式细胞术测定T、B淋巴细胞纯度：取2个流式上样管，其中2管为纯化前的脾细胞悬液对照组，用于测定分选前T、B细胞含量，另外2管为纯化后的T、B 淋巴细胞样品组，用于测定分选后T、B细胞含量。向各管中分别加入5 × 105个脾细胞或T、B 淋巴细胞，并在管中补入含1% FBS的PBS溶液，使得各管总体积为0.5 ml，4°C条件下1000 rpm × 5 min 离心，然后小心倾倒上清，向管底相应加入小鼠Anti-CD3-FITC 或Anti-CD19-PE 荧光标记抗体100 µl/管（含荧光标记抗体原液1 µl），轻微震荡混匀，避光反应30 min。每管加入0.5 ml含1% FBS的PBS再次洗涤细胞，倾倒上清，加入0.5 ml含1% FBS的PBS 缓冲液重悬细胞，锡箔纸避光处理样品管，然后分别上流式细胞记数仪检测细胞纯度。

④将分离的T或B 淋巴细胞培养于RPMI-1640（含10%胎牛血清）完全培养基中，调整细胞数为5 × 106 mL-1。吸取100 µL细胞悬液加至96孔细胞培养板中，分别加入不同浓度的苜蓿多糖，使其终浓度为12.5、25、50、100、200 µg/mL，每样均设置3个重复，并设空白对照孔，置CO2培养箱（5% CO2、37ºC）培养48 h。

（2）MTT法测定淋巴细胞增殖活性（增值指数）：在含有10 %胎牛血清的RPMI1640 培养基中,于96 孔培养板培养淋巴细胞，置入含5 %CO2，95 %空气，37 ℃培养箱继续培养48 h后，每孔加入四氮唑盐(MTT) 10 μL(5 mg/ml)标记，然后再培养8 h，用移液枪收集各孔细胞悬液，置入15 mL离心管中离心，弃上清，加入RPMI1640培养基冲洗，并重新转移到培养孔中，每孔加入15 % SDS 100 μL ，过夜。次日检测各孔OD570 nm值,计算增殖指数。

×100 %

计算公式为：增殖指数(proliferation index ,PI)=实验组OD 值

对照组OD 值

4 h，取出细胞培养板2000 r/min离心10 min，小心吸弃上层液体，再加90 mL DMSO，振荡混匀后放入培养箱中裂解12 h后取出，用酶联免疫检测仪测540 nm下的吸光度值，作为Ｔ、Ｂ淋巴细胞增殖的指标。

（3）IL-2、IL-4、IFN-γ测定：利用ELISA试剂盒按照说明书测定。

（4）抗体含量测定：

2.由以上试验确定刺激T细胞最适的苜蓿多糖浓度，分别加入含有Anti-TLR4、Anti-TLR2、Anti-CR3单克隆抗体、PD98059（MEK-1 抑制剂）、SP600125（（SAPK/JNK 抑制剂）、SB203580（p38抑制剂）以及PDTC（NF-κB p65 抑制剂）的RPMI-1640溶液，继续培养2 h。2 h后加入最适浓度的苜蓿多糖，继续培养24 h。24 h后，无菌EP管小心收集上清，EP管1500 rpm × 10 min离心除去悬浮细胞，重新取上清液，用于测定IL-2、IL-4、IFN-γ含量

3.由以上试验确定刺激B细胞最适的苜蓿多糖浓度，分别加入含有anti-TLR4、anti-CD19、anti-CD79b单克隆抗体、PD98059（MEK-1抑制剂）、SP600125（（SAPK/JNK 抑制剂）、SB203580（p38抑制剂）以及PDTC（NF-κB p65 抑制剂）的RPMI-1640溶液，继续培养2 h。2 h后加入最适浓度的苜蓿多糖，继续培养24 h，测定B细胞增殖能力。无菌EP管小心收集上清，EP管1500 rpm ×10 min离心除去悬浮细胞，重新取上清液，用于测定抗体分泌量。