核酸类药物分析

５硫元素的鉴别
硫鸟嘌呤分子结构中的Ｓ元素在甲醇钠溶液中缓缓加热后会转
化成硫化氢气体，使醋酸铅试纸显黑色或灰色。巯嘌呤分子结 构中的巯基还可与醋酸铅试液反应生成黄色沉淀。
（二）光谱鉴别
１. 紫外吸收光谱法
碱基结构中的嘌呤环和嘧啶环在紫外光区具有特征吸收， 可用于鉴别。 如吸收系数、最大吸收波长及其固定浓度下的吸光度、最 小吸收波长等。
以更昔洛韦的含量测定为例：取本品约０.１５ｇ，精密 称定，加冰醋酸４０ｍｌ，加热使溶解，放冷，加结晶紫指 示液１滴，用高氯酸滴定液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）滴定至溶液 显绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每１ｍｌ的高氯酸 滴定液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）相当于２５.５２ｍｇ的Ｃ９Ｈ １３Ｎ５Ｏ４。
２注意事项 该方法准确度高、精密度好，在具弱碱性原料药的含量测定中应用广泛。但该 方法受到的影响因素较多，必须注意以下问题。
• 阿昔洛韦
• 其化学名为9-(2-羟乙氧甲基）鸟嘌呤。
化学结构式：
• 药理作用： 抗病毒药。体外对单纯性疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞
病毒等具抑制作用。
①干扰病毒DNA多聚酶，抑制病毒的复制； ②在DNA多聚酶作用下，与增长的DNA链结合，引起DNA链的延
伸中断。本品对病毒有特殊的亲和力，但对哺乳动物宿主细胞毒性低。
出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。
３嘌呤碱的鉴别 含有嘌呤碱的核酸类药物在水溶液中可与氨制硝酸银试液反应，
生成白色的银盐，遇光变为红棕色。此反应为嘌呤碱的特征鉴别
反应。
４氟元素的鉴别
氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有机化合物遇强氧化剂如三氧化铬
的饱和硫酸溶液时，在微热条件下会产生氟化氢，腐蚀玻璃表 面造成硫酸溶液不能均匀涂于管壁，产生类似油垢的现象。
核酸碱基类药物只有碱基，呈碱性。
４水解性 核苷酸类药物分子结构中磷酸与戊糖间的酯键和戊糖与碱基间的糖苷键都 会发生水解，同样条件下酯键先水解。
第二节
分析方法
各种核酸类药物都含有碱基，都具有弱碱性和紫外吸收 性质；
多核苷酸、核苷酸、核苷类药物中均含有戊糖；
多核苷酸和核苷酸结构中都含有磷酸。
因此它们有一些共同的分析方法，如用紫外分光光度法进
的溶液，取２０μｌ注入液相色谱仪，环磷腺苷峰与相邻杂质峰 的分离度应符合要求，理论板数按环磷腺苷峰计算不得低于２ ０００，拖尾因子应小于１.４。
２离子交换色谱法 核酸类药物结构中有含氮碱性基团、多羟基糖苷，有些 还以磷酸盐形式存在，这些基团会与常规的Ｃ１８色谱柱上 的残留硅醇羟基发生氢键吸附，造成峰形拖尾和柱压升 高，不利于分离测定。利用该类药物在适当条件下可发生离 子化的性质，改用离子交换树脂（如磺化交联的苯乙烯－二 乙烯基共聚物） 作为固定相填料，通过离子交换原 理进行分离，可以有效改善拖尾的问题。 《中国药典》从２００５年版开始改用阳离子交换色 谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。
毒素、异常毒性、无菌检查等，重点介绍从原料中带入或在生 产过程中引入的杂质、污染物或其他成分等特殊杂质。
（一）多核苷酸类药物的检查
１吸光度 核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法从细胞或动物内脏制得，如核 糖核酸Ⅰ系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程中不可避免会带入一定的 蛋白质，吸光度检查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。具体方法是 配制一定浓度的供试液，分别在２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的波长处测定吸
行鉴别或含量测定。
一、鉴别 （一）化学鉴别 １戊糖的鉴别 （１）地衣酚反应 核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷与酸共热时，水解形成的戊糖基脱水变为糠 醛，再与３，５二 羟基甲苯（地衣酚） 反应，缩合生成绿色化合物。用三价铁盐或铜盐作催化 剂，可增加呈色的灵敏度。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。
２含氯量 盐酸阿糖胞苷的生产过程中可能会因成盐不完全或产生一 些其他的盐酸盐杂质，造成药物中盐酸的含量发生变化， 即氯含量发生变化。因此通过含氯量测定可控制其纯度。 ３含氟量 氟尿嘧啶原料药中氟化程度也可通过含氟量来进行控制。
三、含量测定
核酸类药物结构中的嘧啶碱和嘌呤碱，具有一定的弱
碱性，可采用非水碱量法进行含量测定；
光度，要求该吸光度比值应不得低于１.７。
纯ＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ波长处的吸光度比值在２.０以 上，ＤＮＡ的吸光度比值为１.９左右；当样品中蛋白质含量增加时该比
值会下降。
２核糖核酸中脱氧核糖核酸的检查 检查原理:脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性条件下与
二苯胺反应会生成蓝色化合物，在６００ｎｍ附近有最大
第三节 应用实例
一、巯嘌呤 巯嘌呤为次黄嘌呤类似物，通过抑制核酸合成而发挥抗肿瘤作用。药用为含 一个结晶水的巯嘌呤。本品主要经化学合成法制备。 巯嘌呤主要以氰乙酸乙酯为原料进行合成。在加热的无水乙醇与乙醇钠溶液中， 氰乙酸乙酯先与硫脲环合生成２－巯基－４－氨基－６－羟基嘧啶，经亚硝基化、还原 得２－巯基－４，５－二氨基－６－羟基嘧啶，然后在活性镍的作用下，消除巯基得４， ５－二氨基－６－羟基嘧啶，进一步与甲酸环合成６－羟基嘌呤，然后在吡啶溶液中与 五硫化二磷在１１８℃反应４ｈ制得巯嘌呤。
（二）核苷酸、核苷、核酸碱基类药物的检查 １有关物质
结构相似的其他非目标化合物，即有关物质。
以硫鸟嘌呤中“有关物质”检查为例进行说明。 硫鸟嘌呤是以鸟嘌呤为原料制备而得，终产品中可能带入残 留的原料、中间体、副反应产物等结构与硫鸟嘌呤类似的杂
质，统称为“有关物质”。该类杂质中，鸟嘌呤是已知杂质
且有对照品，采用对照品对照法进行检查；其他杂质则采用 不加校正因子的主成分自身对照法进行检查。
核酸类药物分析
第一节 第二节 第三节
概 述 分析方法 应用实例
第一节 概 述
一、结构与分类 • 核酸类药物可以通过帮助恢复正常代谢或干扰某些异常代 谢来达到治疗疾病的目的。 • 核酸是由多个单核苷酸通过３′，５′磷酸二酯键聚合而成
的生物大分子，单核苷酸的基本结构包括核苷和磷酸，核
苷是含氮碱基（嘌呤碱与嘧啶碱） 与戊糖通过糖苷键缩 合而成。根据戊糖的种类可将核酸分为核糖核酸和脱氧核 糖核酸。
绿色 670nm
（２）二苯胺反应 脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产
生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物，
在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。 核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。
蓝色 595nm
２磷酸盐的鉴别 核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解产生的磷酸与过量
的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼酸铵放冷析
二、理化性质 １溶解性 多核苷酸、核苷酸类药物均为磷酸盐，除环磷腺苷外，在水中均易溶。
核苷类药物在乙醇、乙醚等有机溶剂中的溶解度均较差，部分核苷类 药物在水中易溶（如利巴韦林），部分核苷类药物在水中微溶（如肌 苷）。核酸碱基类药物大多能溶于酸性或碱性溶剂，如氟胞嘧啶，在稀 盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。
其共轭结构具有一定的紫外吸收，可通过测定最大吸
收波长的吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的ＨＰ ＬＣ法定量。 核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外 分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能
力的高效液相色谱法。
（一）非水碱量法 １原理 核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱，在水溶 液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。 而在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加， 可被高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积 即可计算该类药物的含量。
利巴韦林的含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 用磺化交联的苯乙烯－ 二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用 稀硫酸调节ｐＨ值至２.５±０.１） 为流动相；检测 波长为２０７ｎｍ。理论板数按利巴韦林峰计算不低于２０ ００。 离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入 适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解 度。
２紫外吸收 核苷酸的磷酸酯和戊糖均没有明显的紫外吸收，而嘌呤碱和嘧啶碱等碱基
具有共轭双键结构，在紫外光区有明显吸收。因此多核苷酸、核苷酸和核苷
与构成它们的碱基具有相似的紫外吸收光谱，最大吸收波长一般在２６０ｎ ｍ附近。
３酸碱性 核苷酸分子结构中的磷酸和戊糖均呈酸性，其中磷酸酸性较强，碱基为含 氮化合物呈弱碱性，故多核苷酸、核苷酸类和核苷类药物均为两性化合物。
１离子对色谱法 核苷酸类药物的磷酸基在反相高效液相色谱条件下经 常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和测定。 离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的色谱保 留，实现准确定量。 《中国药典》（２０１５年版） 收载的环磷腺苷、三磷 酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含量测 定。 离子对色谱法是在流动相中加入适量的反离子，使其与 呈解离状态的待测组分形成离子对，增加其在非极性固定 相上的分配，从而改善其色谱保留与分离行为。 核苷酸为酸性物质，故其离子对试剂常用季铵盐阳离子 试剂，如四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵。离子对色谱的 影响因素较多，包括反离子的性质和浓度、流动相的组成、 ｐＨ值和离子强度等，需仔细选择。
２红外吸收光谱法 红外吸收光谱法主要分为标准图谱对照法或对照品对照法，《中国药典》 主要采用标准图谱对照法。 红外光谱具有叠加性，共存组分会使待测组分的红外光谱图发生变化， 因此红外吸收光谱法一般用于纯度较高的原料药的鉴别。
影响红外吸收光谱的因素较多: 如试样的制备方法、水分、晶型等，因此鉴别时应严格按规定绘制图谱。 对于可能发生转晶的药物，需按规定重结晶后再绘制图谱，如更昔洛韦的鉴 别，本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致，如不一致，取本品和对 照品适量，分别加水制成饱和溶液，滤过，取滤液在１０℃以下放置过夜， 待析出结晶，滤过，滤渣经１０５℃干燥后，再次测定。
吸收，而核糖核酸无此反应。通过控制６００ｎｍ处的吸 光度，即可控制脱氧核糖核酸的含量。
３增色效应 核酸分子解链变性或断链时，其发色基团———碱基
暴露后，会造成紫外吸收增强的现象。但其他的杂质，如
蛋白质也具有增色效应，故通过要求增色效应不得低于某 个数值，可以控制相关杂质。如核糖核酸Ⅰ要求本品的增 色效应大于３０％.
核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、 核苷Baidu Nhomakorabea碱基以及它们的类似物或衍生物。 按照化学结构和组成可分成四类：
①核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等；
②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林、阿糖胞苷；
③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷
腺苷； ④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗肿 瘤免疫核糖核酸等。
（１）水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，所以反应体系中不应有水分。 （２）由于所用溶剂———冰醋酸有挥发性且膨胀系数较大，高氯酸滴定液的浓 度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温度差对高氯酸滴定液浓度的 影响很大，一般温度差小于１０℃时，滴定液的浓度经校正后即可用于定量计算； 若温度差超过１０℃，则应重新标定滴定液的浓度。高氯酸滴定液的浓度校正公 式如下：
（３）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定 结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品，
同法操作，所得结果应扣除空白。
（４）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但
指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。
（二）紫外分光光度法
嘌呤碱基和嘧啶碱基的紫外吸收特征除了可用于 鉴别外，还可用于该类药物的含量测定。 《中国药典》（２０１５年版） 收载的巯嘌呤、 氟尿嘧啶和别嘌醇的原料药均采用紫外分光光度法中 的吸收系数法进行含量测定。 （三）高效液相色谱法 大多数核酸类药物可用常规的反相高效液相色谱 法进行分离测定，但部分结构中存在极性基团的核酸 类药物采用常规方法分离时，效果较差，需改用一些 特殊的高效液相色谱法，如离子对色谱法或离子交换 色谱法。
环磷腺苷的含量测定:
色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾与四丁基溴 化铵的混合溶液 为流动相；检测波长为２５８ｎｍ。 取环磷腺苷对照品约１０ｍｇ，加水５ｍｌ使溶解，加１ｍｏ ｌ／Ｌ的盐酸溶液１ｍｌ，水浴加热３０ｍｉｎ后冷却，用氢
氧化钠试液调至中性，用水稀释制成每１ｍｌ中约含０.２ｍｇ
二、检查 核糖核酸、脱氧核苷酸钠多采用提取法制备，寡聚核苷酸 多采用化学合成法，核酸碱基、核苷、核苷酸类药物大多采用 酶解法、发酵法和半合成法制备。
核酸类药物的杂质检查包括一般杂质检查、特殊杂质检查和 安全性检查。 一般杂质检查主要有氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、铵
盐、铁盐、干燥失重、炽灼残渣等，安全性检查主要有细菌内