梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析

园艺学报，（）：– 2014411121962207 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@

收稿日期：2014–07–08；修回日期：2014–10–10 基金项目：国家自然科学基金项目（31201592）

梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析

蒋 爽，蔡丹英，滕元文*

（浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）

摘 要：基于生物信息学方法对‘酥梨’基因组中不同类型的逆转录酶进行预测，共获得345条copia 类和99条gypsy 类逆转录酶。通过系统聚类，copia 类逆转录酶可分为Ivana 、Ale 、TAR 、Angela 、Maximus 和Bianca 等6类；gypsy 类逆转录酶可分为Athila 、Tat 、CRM 、Reina 和Tekay 等5类。序列比对结果显示梨中逆转录酶具有较高的异质性，copia 类逆转录酶序列分歧度为0.44，gypsy 类为0.38。挑选出8类逆转录酶设计引物，并对梨属其它植物进行PCR 扩增，结果显示这8类逆转录酶广泛存在于梨属植物中。在砂梨品种‘圆黄’的叶片、种子和果实中均发现该8类逆转录酶存在一定的转录水平，这是首次发现在梨属植物正常生长组织中逆转录酶发生转录。

关键词：梨；Ty1-copia ；Ty3-gypsy ；逆转录酶；预测

中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2014）11-2196-12

Prediction ，Evolution and Expression Analysis of Reverse Transcriptase of LTR Retrotransposons in Pear

JIANG Shuang ，CAI Dan-ying ，and TENG Yuan-wen *

（Department of Horticulture ，The State Agricultural Ministry Laboratory of Horticultural Plant Growth ，Development & Quality Improvement ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）

Abstract ：Different types of reverse transcriptase （RT ）sequences in the whole genome of Pyrus pyrifolia white pear group ‘Suli ’were predicted by bioinformatics methods. A total of 345 RT sequences were obtained from copia group and 99 RT sequences were from gypsy group. The cluster analysis indicated that there were six lineages （Ivana ，Ale ，TAR ，Angela ，Maximus and Bianca ）in copia group and five lineages in gypsy group （Athila ，Tat ，CRM ，Reina and Tekay ）. Sequence alignment showed a high heterogeneity in both copia group and gypsy group ，and the divergence of RT in both groups was 0.44 and 0.38，respectively. Eight types of RT were selected to design primers ，each pair of primers showed clear amplified bands by PCR using genomic DNA of other Pyrus species. Eight types of RT were expressed with different levels in leaves ，seeds and fruits of ‘Wonhwang ’pear ，which was the first report on the expression of RT in the organs of pear trees under normal growing condition.

Key words ：Pyrus ；Ty1-copia ；Ty3-gypsy ；reverse transcriptase ；prediction

* 通信作者 Author for correspondence （E-mail ：ywteng@ ）

11期蒋爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2197

反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子，它们以RNA为媒介，在基因组中不断自我复制（Beauregard et al.，2008）。在高等植物中，反转录转座子有丰富的拷贝，是基因组的重要成分之一（Ellis et al.，1998；Kalendar et al.，2000；Petit et al.，2007）。反转录转座子的转座机制不同于其它转座元件，它首先转录形成RNA，再以RNA为媒介在逆转录酶作用下逆转录成DNA，最终插入到基因组的靶基因片段上。这种“复制—粘贴”的转座机制使得反转录转座子能够快速自我扩增，从而在漫长的进化历史中改变整个基因组的大小（Kumar & Bennetzen，1999；Havecker et al.，2004）。植物中反转录转座子根据其结构域可以分为5大类型（Wicker & Keller，2007），其中以LTR反转录转座子报道较多。逆转录酶在LTR反转录转座子转座过程中发挥重要的作用，而在梨基因组中，25.5%和16.9% 的基因组为copia类型和gypsy类型反转录转座子（Wu et al.，2013）。因而逆转录酶的特征及其转录水平是深入研究反转录转座子在梨属植物进化过程中作用的关键。Wicker和Keller（2007）在研究水稻、小麦和拟南芥的逆转录酶后认为在单子叶和双子叶植物分化前copia类型逆转录酶就存在有6个原始支系，分别为Maximus、Ivana、Ale、Angela、TAR和Bianca。植物中gypsy类型逆转录酶也可以分为6大支系，分别为Galadriel、CRM、Reina、Takay、Tat和Athila（Lloren et al.，2009）。

逆转录酶基因序列存在保守部分，前人的研究中多使用简并引物采用基因克隆方式测序得到反转录转座子中的逆转录酶序列（Ma et al.，2008；刁卫平等，2012；范付华等，2012；Fan et al.，2013）。周鹏等（2014）通过简并引物从早酥梨及红色芽变材料中共扩增获得了59条copia类型逆转录酶序列。但通过PCR扩增方式获得序列存在以下不足：（1）使用的简并引物并不能通用于所有植物；（2）使用克隆测序得到的序列多为逆转录酶的部分序列；（3）通过PCR扩增并不能够扩增出全部类型的逆转录酶序列。由于一些分布广泛的逆转录酶在PCR过程中存在优势扩增现象，造成测序结果中逆转录酶类型少。随着越来越多的生物基因组的公布，可以用生物信息学的方法进行预测，从而克服上述缺点。本研究中使用生物信息学的方法从已经公布的‘酥梨’基因组（Wu et al.，2013）数据中分离出编码逆转录酶的基因序列，并分析这些序列的特点，同时根据一些高同源性的逆转录酶基因序列设计引物并对其在梨不同组织中的转录水平进行研究，进一步了解反转录转座子在梨属植物中的转座情况，有助于深入了解梨属植物进化过程中的基因组变化。

1 材料与方法

1.1试验材料

以‘酥梨’基因组数据（AJSU00000000）为基础，采用生物信息学方法预测逆转录酶序列。2013年4月选择‘圆黄’（Pyrus pyrifolia Nakai‘Wonhwang’）、‘酥梨’（P. pyrifolia white pear group‘Suli’）（Bao et al.，2008）、杜梨（P. betulaefolia Bge.）、‘考密斯’（P. communis L.‘Comice’）叶片提取DNA（Doyle & Doyle，1987）作为后续试验的PCR模板。从‘圆黄’梨的叶片、果肉、果皮及种子中提取RNA（Zhang et al.，2011），用分光光度计测试浓度，选择1 μg RNA逆转录成cDNA备用。

1.2逆转录酶序列的预测及聚类分析

采用LTR-harvest（Ellinghaus et al.，2008）对‘酥梨’基因组进行反转录转座子的预测，将预测获得的反转录转座子和Repbase（http：///repbase/）数据库进行比对并将反转录转座子分为copia类型和gypsy类型，将分类后的序列翻译成氨基酸序列（http：///Tools/st/ emboss_transeq/）。采用Hmmer3.0（Eddy，1998）并根据RVT_1（Pfam：PF00078）和RVT_2（Pfam：