细菌转化实验原理和操作步骤

细菌转化实验原理与操作步骤

转化(tｒａnsｆｏrmatｉoｎ)就是指一段同源或异源的DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,就是现代分子生物学研究与基因工程不可缺少的重要技术。

关键词:细菌转化细菌转化

一、实验目的

1.以pGLO 质粒转化大肠杆菌为例,学习转化的基本原理及方法。

2 、验证DNA 就是遗传物质,加深对中心法则的理解。

二、实验原理

转化( ｔransformatioｎ)就是指一段同源或异源的ＤNＡ转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程,就是现代分子生物学研究与基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl 2 法( 化学转化法)与电转化法。本实验就是用pGＬO 细菌转化试剂盒中提供的pGＬO 质粒来转化大肠杆菌,所用方法为CaCl 2 转化法。

pGLＯ质粒:

pＧLO 质粒上主要含有两个基因,一个为编码绿色荧光蛋白(GFP) 的基因,一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外,该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系,转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光,这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。

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三. 实验材料

受体菌: E.coｌi K12 HB101

质粒: pGLO pｌaｓmid

转化液( ＣaCl2 )

氨苄青霉素( aｍp )

阿拉伯糖( ara )

培养基:固体LＢ、液体ＬB

接种环、移液器等

四. 实验步骤

１. 准备平板: 每组: 1块ＬB 平板, 2 块ＬB/aｍp 平板, 1 块LB/amp/ａｒa 平板2. 准备感受态细胞:用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉,此即感受态细胞。

3、活化受体细胞:挑取1 环E.colｉK12ＨB101 菌液,于LB 培养基上３７℃活化16－24ｈ。

１) 在两只无菌离心管上分

别标

记＋DＮA,-ＤNA 。

2) 在上述两管中分别加入

250 μ l 转化液。

３) 迅速置于冰上。

4)各挑取活化好的受体菌

的一

个单菌落,悬浮于两管转化

液中。

5) 在标有+DＮＡ的管中

加入一

环质粒DＮＡ,而标有－

DNA 的管中不加。

6) 将上述两管于冰上放置

10min。

7) 在准备好的培养基底部如左图。

8 )两只小管放入42℃水浴中处理5０秒,再迅速放于冰上2 min 。

9 )在两只小管中分别加入250 μ l LB- 肉汤。

10 )从+DNA小管中分别吸取１00 μ ｌ滴加在两个标有＋ＤNA 的平板上,从-DNA小管中分别吸取100 μ l 滴加在两个标有-D ＮA 的平板上。

１1 )用无菌接种环将滴加的液体均匀涂布在平板上。

1２)将上述四只平板固定,并于４2 ℃培养箱中培养 2 天。ﻫ

13)在长波紫外灯下观察结果,记录各平板上的菌落数