分子生物学第8章
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性
不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:
• ①DNA浓度越高，两股互补链相遇的可能性就越大，因而 复性越快
• ②序列简单的DNA(例如重复序列)复性快，序列复杂的 DNA(例如单一序列)复性慢，因而可以通过测定复性速度分 析DNA序列的复杂性
• ③DNA片段越大，寻找完全互补序列的难度就越大，因而 复性越慢
• ④DNA溶液的离子强度越高，两股互补链重新结合的速度 就越快，因而复性越快
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
三、杂交与核酸分子杂交技术
• 杂交定义
–不同来源的、序列互补的单链RNA、 DNA， 或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连 接为双链分子的过程。
• 核酸杂交类型
–单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA） –单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA） –单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）
• 种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流控芯片和芯片实验室 • 固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龙膜等 • 特点：高通量、集成化、标准化和微型化
一、基因芯片（gene chip）
DNA芯片 、DNA微阵列 、寡核苷酸微阵列
• 定义: 是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量 DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面，然后与 标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样 品的信号（即基因序列或表达的信息）
①为了保持RNA呈单链状态进行电泳，以使RNA按分子大小分离，需 要先用变性剂将RNA样品完全变性，再电泳分离 ②RNA样品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜 (DMSO)等变性，不能 用碱变性，因为碱会导致RNA降解。 • RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一特 定RNA，特别是分析mRNA的大小和含量，从而研究基因表达。 • 避免RNase污染，包括抑制内源性RNase的活性
三、斑点杂交法和狭缝杂交法
• 将粗制或纯化的DNA或RNA样品变性之后直接点 于固相膜表面，经过固定、预杂交之后与过量探针 进行杂交分析
• 印迹:圆斑(dot),短线(slot) • 用于检测DNA样品的同源性、细胞内特定基因的
拷贝数和基因表达情况 • 优点:用样量少，操作简便，不电泳和转移，在同一
2、体外标记（最常用）：化学法和酶促法 • 化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上
的基团进行交联，将标记物直接结合到探针分子上。 简便快速、标记均匀 • 酶促法：先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将 标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转 移到探针分子
(一)切口平移标记法
(二)随机引物标记法
• 基本操作分为四个步骤 • 芯片制作 • 样品制备 • 分子杂交 • 检测分析
1·芯片制作
• 一个复杂而精密的过程，需要专门的仪器 (1)原位合成法: • 光引导原位合成法 • 分子印章法 (2)微量点样法: • 喷墨打印（微孔） • 接触打印（点样针）
2·样品制备 • 待测样品（Cy3）；对照样品（Cy5） 3.分子杂交 • 探针含量远多于待测DNA含量（杂交信号强弱与待
（正常探针，突变探针） • 诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症(PKU) ，根据某个突变位点 (例如
Arg243Gln)设计一对探针:
• 用两种探针分别和待测DNA杂交，显性纯合子只与正常探针杂交， 杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因 此根据杂交结果可以判断待测个体的基因型
性 4·↓离子强度和↑甲酰胺浓度：↓最适杂交温度 5.杂交时间：控制在20小时左右 6·杂交促进剂:＞250nt探针杂交用惰性多聚体(硫酸葡聚糖
/PEG) 7.非特异性杂交：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性DNA 、
高分子化合物）封闭非特异性杂交位点
第六节 蛋白质印迹法
• 蛋白质印迹法可以用于定性和半定 量分析混合物中的蛋白质
• 核酸双螺旋区的氢键断裂，变 成单链，但并不涉及共价键的 断裂
DNA解链曲线
DNA变性的本质是氢键的断裂
核酸的变性因素
• 变性方法
–热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、 尿素和甲酰胺 ）
• 增色效应（hyperchromic effect） 由于DNA变性而引起的光吸收增加的 现象
• 使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度 (Tm)、变性温 度、熔点
第八章 印迹杂交技术
•分子生物学常用的分析技术之一
DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）
第一节 核酸分子杂交
• 核酸杂交技术是在DNA变性和复 性原理的基础上建立起来的一种 分子生物学技术
一、变性（denaturation）
• 在某些理化因素的作用下，维 系核酸二级结构的氢键和碱基 堆积力受到破坏，DNA双螺旋 结构松散，变成单链的过程称 为核酸的变性
• 基本原理依然是基于核酸分子杂交，属于固相杂交 • 不同：探针固相化、集成化并且不标记;而待测样品游离于
液相并且被标记
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
(一)基本原理和基本操作
• 基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的 高通量检测DNA的技术
• 苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子
第五节 影响杂交的因素
• 核酸分子杂交的效果取决于杂交的特异性和杂交的效率 1·核酸分子大（↓）小和浓度（正相关） 发生碰撞才可能杂交 2·探针种类和浓度：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而提
高，双链探针与此相反 3·杂交温度：最适杂交温度(比解链温度低20-25℃时)；特异
否存在，比较其在不同细胞内的含量 • 不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有
可比性
三种印迹技术的比较
第七节 生物芯片
• 定义：也称为生物微阵列，是指通过微电子、微加工技术，用生物大 分子 (例如核酸、蛋白质)或细胞等在数平方厘米大小的固相介质表面 构建的微型分析系统，用以对生物组分进行快速、高效、灵敏的分析 与处理
• 分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式 • 荧光原位杂交 (FISH)是用荧光素标记探针进行的原位杂
交①灵敏、稳定、安全、直观②多色荧光原位杂交可以 同时分析多种靶序列
荧光标记探针检测精子
五、菌落杂交和噬菌斑杂交
六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)
• ASOH：最早检测已知点突变，目前广泛采用的基因诊断方法 • 关键：设计一对ASO，长度15-20nt，只有一个碱基不同，对应突变位点
测DNA含量成正比） • 优化杂交条件：离子强度、温度、时间 4、检测分析 • 以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上
DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来
1、液相杂交：待测核酸和标记的探针都游离于溶液中，在一定条件 下进行杂交
• 优点：速度快、效率高，操作简便 • 缺点：难以有效避免待测核酸的复性
杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大 2、固相杂交：将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的
游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上 • 优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交
二、探针标记物
(一)放射性同位素标记物(32P、2H和32S) • 极高的灵敏度和特异性 • 放射性污染,半衰期短,昂贵 (二)非放射性标记物(生物素、地高辛和荧光素等) • 实验周期短;稳定性好,标记探针可以长时间存放备用;无放
射性污染 • 灵敏度和特异性有时不理想
三、探针标记法
1、体内标记：将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收 之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子
• 综合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率 高和固相免疫分析特异性高、灵敏 度高等优点
一、基本内容
二、注意事项
1·选用合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度 2·印迹时，应选用小孔径的固相膜，以免小分子量蛋
白质透过固相膜丢失 3·蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，
所以一般只用于半定量分析 • 即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是
• DNA的解链温度一般在82-95℃ ，与DNA的分子大小和碱基组成、 溶液的pH值和离子强度（+）等有关
二、复性
• DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新 形成互补双链结构
• DNA的最适复性温度通常比解链温度低2025℃
• 复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应 • 检测DNA紫外吸收的变化可以分析其变性和复
• 常用的核酸分子杂交技术多为固相杂交 • 根据操作方法的不同分为 • 印迹杂交：将凝胶电泳的高分辨率与核酸分子杂交的
高灵敏度相结合，包括DNA印迹法和RNA印迹法等 • 原位杂交：包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌
斑杂交法等
核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段
末端标记法
(三)聚合酶链反应标记法 • 一种标记dNTP和三种普通dNTP为底物，短链探
针 (四)末端标记法 • T4多核苷酸激酶、末端转移酶、Klenow片段和
T4 DNA聚合酶
四、探针纯化
1·乙醇沉淀法 • DNA片段可以被无水乙醇沉淀 • 操作简便，首选方法 2·凝胶过滤法 • 利用凝胶的分子筛特性 • 凝胶填料是Sephadex G-50和Bio-Gel P-60
核酸分子杂交技术
• 定义：将已知序列的单链核酸片段进行标记后，再 与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中 鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因 序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的 表达情况
• 探针(Probe)：是带有标记物且序列已知、用于鉴定 互补序列的单链核酸片段
根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：
张固相膜上可以分析多个样品 • 缺点:特异性不高,不能分析样品的分子量
斑点杂交和狭缝杂交
• 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
• 优点：简便、快速、灵敏、样本用量少 • 缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性
NCF
点样板
96孔
滤纸
支撑板
12×8
至真空泵
废液储槽
四、组织原位杂交(in situ hybridization)
一、探针种类
1·基因组DNA探针（最常用的DNA探针） • 多为某一基因的全部序列或部分序列 2·RNA探针 • 杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强 • 非特异性杂交较少、低本底 3·cDNA探针 • 不含内含子等非编码序列，特异性高，研究基因表达 • 不易制备 4·寡核苷酸探针 • 根据已知核酸序列人工合成的DNA探针;分析点突变 5·锁式探针 • 一种特别设计的DNA探针，中间为连接序列 6·实时定量PCR探针
第三节 固相支持物与印迹
一、固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙烯二 氟(PVDF)膜和活化滤纸
1·硝酸纤维素膜 • 结合量大、本底较低、操作简便 • 结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆 2·尼龙膜 • 韧性较强，不易破裂 • 中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜
二、印迹方法
第四节 常用核酸印迹杂交技术
• 把组织切片进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后 置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与DNA或 RNA杂交
• 以cDNA为探针检测与其互补的mRNA在细菌或其他真 核细胞中的位置，称为RNA原位杂交，是分析基因表达 的常用方法
• 不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸 的组织、细胞、亚细胞甚至染色体定位
预杂交
制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
wk.baidu.com
一、DNA印迹法
1.样品制备；2.电泳分离； 3.变性； 4·印迹； 5·固定； 6·预 杂交；7.杂交；8·洗膜；9·分析
放射自显影照片
二、RNA印迹法
• RNA印迹法分析的待测核酸是RNA • 与DNA印迹法基本一致，所不同的是:
的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便 • 印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的
第二节 探针与标记
• 合适的探针具备以下条件: ①具有高度特异性，只与待测核酸杂交。因此，通
常首选编码序列制备探针 ②为单链核酸，用双链核酸制备的探针使用前要先
变性解链 ③带有标记物，标记物灵敏度高而稳定，检测方便
不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:
• ①DNA浓度越高，两股互补链相遇的可能性就越大，因而 复性越快
• ②序列简单的DNA(例如重复序列)复性快，序列复杂的 DNA(例如单一序列)复性慢，因而可以通过测定复性速度分 析DNA序列的复杂性
• ③DNA片段越大，寻找完全互补序列的难度就越大，因而 复性越慢
• ④DNA溶液的离子强度越高，两股互补链重新结合的速度 就越快，因而复性越快
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
三、杂交与核酸分子杂交技术
• 杂交定义
–不同来源的、序列互补的单链RNA、 DNA， 或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连 接为双链分子的过程。
• 核酸杂交类型
–单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA） –单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA） –单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）
• 种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流控芯片和芯片实验室 • 固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龙膜等 • 特点：高通量、集成化、标准化和微型化
一、基因芯片（gene chip）
DNA芯片 、DNA微阵列 、寡核苷酸微阵列
• 定义: 是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量 DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面，然后与 标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样 品的信号（即基因序列或表达的信息）
①为了保持RNA呈单链状态进行电泳，以使RNA按分子大小分离，需 要先用变性剂将RNA样品完全变性，再电泳分离 ②RNA样品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜 (DMSO)等变性，不能 用碱变性，因为碱会导致RNA降解。 • RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一特 定RNA，特别是分析mRNA的大小和含量，从而研究基因表达。 • 避免RNase污染，包括抑制内源性RNase的活性
三、斑点杂交法和狭缝杂交法
• 将粗制或纯化的DNA或RNA样品变性之后直接点 于固相膜表面，经过固定、预杂交之后与过量探针 进行杂交分析
• 印迹:圆斑(dot),短线(slot) • 用于检测DNA样品的同源性、细胞内特定基因的
拷贝数和基因表达情况 • 优点:用样量少，操作简便，不电泳和转移，在同一
2、体外标记（最常用）：化学法和酶促法 • 化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上
的基团进行交联，将标记物直接结合到探针分子上。 简便快速、标记均匀 • 酶促法：先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将 标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转 移到探针分子
(一)切口平移标记法
(二)随机引物标记法
• 基本操作分为四个步骤 • 芯片制作 • 样品制备 • 分子杂交 • 检测分析
1·芯片制作
• 一个复杂而精密的过程，需要专门的仪器 (1)原位合成法: • 光引导原位合成法 • 分子印章法 (2)微量点样法: • 喷墨打印（微孔） • 接触打印（点样针）
2·样品制备 • 待测样品（Cy3）；对照样品（Cy5） 3.分子杂交 • 探针含量远多于待测DNA含量（杂交信号强弱与待
（正常探针，突变探针） • 诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症(PKU) ，根据某个突变位点 (例如
Arg243Gln)设计一对探针:
• 用两种探针分别和待测DNA杂交，显性纯合子只与正常探针杂交， 杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因 此根据杂交结果可以判断待测个体的基因型
性 4·↓离子强度和↑甲酰胺浓度：↓最适杂交温度 5.杂交时间：控制在20小时左右 6·杂交促进剂:＞250nt探针杂交用惰性多聚体(硫酸葡聚糖
/PEG) 7.非特异性杂交：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性DNA 、
高分子化合物）封闭非特异性杂交位点
第六节 蛋白质印迹法
• 蛋白质印迹法可以用于定性和半定 量分析混合物中的蛋白质
• 核酸双螺旋区的氢键断裂，变 成单链，但并不涉及共价键的 断裂
DNA解链曲线
DNA变性的本质是氢键的断裂
核酸的变性因素
• 变性方法
–热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、 尿素和甲酰胺 ）
• 增色效应（hyperchromic effect） 由于DNA变性而引起的光吸收增加的 现象
• 使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度 (Tm)、变性温 度、熔点
第八章 印迹杂交技术
•分子生物学常用的分析技术之一
DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）
第一节 核酸分子杂交
• 核酸杂交技术是在DNA变性和复 性原理的基础上建立起来的一种 分子生物学技术
一、变性（denaturation）
• 在某些理化因素的作用下，维 系核酸二级结构的氢键和碱基 堆积力受到破坏，DNA双螺旋 结构松散，变成单链的过程称 为核酸的变性
• 基本原理依然是基于核酸分子杂交，属于固相杂交 • 不同：探针固相化、集成化并且不标记;而待测样品游离于
液相并且被标记
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
(一)基本原理和基本操作
• 基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的 高通量检测DNA的技术
• 苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子
第五节 影响杂交的因素
• 核酸分子杂交的效果取决于杂交的特异性和杂交的效率 1·核酸分子大（↓）小和浓度（正相关） 发生碰撞才可能杂交 2·探针种类和浓度：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而提
高，双链探针与此相反 3·杂交温度：最适杂交温度(比解链温度低20-25℃时)；特异
否存在，比较其在不同细胞内的含量 • 不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有
可比性
三种印迹技术的比较
第七节 生物芯片
• 定义：也称为生物微阵列，是指通过微电子、微加工技术，用生物大 分子 (例如核酸、蛋白质)或细胞等在数平方厘米大小的固相介质表面 构建的微型分析系统，用以对生物组分进行快速、高效、灵敏的分析 与处理
• 分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式 • 荧光原位杂交 (FISH)是用荧光素标记探针进行的原位杂
交①灵敏、稳定、安全、直观②多色荧光原位杂交可以 同时分析多种靶序列
荧光标记探针检测精子
五、菌落杂交和噬菌斑杂交
六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)
• ASOH：最早检测已知点突变，目前广泛采用的基因诊断方法 • 关键：设计一对ASO，长度15-20nt，只有一个碱基不同，对应突变位点
测DNA含量成正比） • 优化杂交条件：离子强度、温度、时间 4、检测分析 • 以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上
DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来
1、液相杂交：待测核酸和标记的探针都游离于溶液中，在一定条件 下进行杂交
• 优点：速度快、效率高，操作简便 • 缺点：难以有效避免待测核酸的复性
杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大 2、固相杂交：将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的
游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上 • 优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交
二、探针标记物
(一)放射性同位素标记物(32P、2H和32S) • 极高的灵敏度和特异性 • 放射性污染,半衰期短,昂贵 (二)非放射性标记物(生物素、地高辛和荧光素等) • 实验周期短;稳定性好,标记探针可以长时间存放备用;无放
射性污染 • 灵敏度和特异性有时不理想
三、探针标记法
1、体内标记：将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收 之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子
• 综合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率 高和固相免疫分析特异性高、灵敏 度高等优点
一、基本内容
二、注意事项
1·选用合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度 2·印迹时，应选用小孔径的固相膜，以免小分子量蛋
白质透过固相膜丢失 3·蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，
所以一般只用于半定量分析 • 即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是
• DNA的解链温度一般在82-95℃ ，与DNA的分子大小和碱基组成、 溶液的pH值和离子强度（+）等有关
二、复性
• DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新 形成互补双链结构
• DNA的最适复性温度通常比解链温度低2025℃
• 复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应 • 检测DNA紫外吸收的变化可以分析其变性和复
• 常用的核酸分子杂交技术多为固相杂交 • 根据操作方法的不同分为 • 印迹杂交：将凝胶电泳的高分辨率与核酸分子杂交的
高灵敏度相结合，包括DNA印迹法和RNA印迹法等 • 原位杂交：包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌
斑杂交法等
核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化DNA片段
末端标记法
(三)聚合酶链反应标记法 • 一种标记dNTP和三种普通dNTP为底物，短链探
针 (四)末端标记法 • T4多核苷酸激酶、末端转移酶、Klenow片段和
T4 DNA聚合酶
四、探针纯化
1·乙醇沉淀法 • DNA片段可以被无水乙醇沉淀 • 操作简便，首选方法 2·凝胶过滤法 • 利用凝胶的分子筛特性 • 凝胶填料是Sephadex G-50和Bio-Gel P-60
核酸分子杂交技术
• 定义：将已知序列的单链核酸片段进行标记后，再 与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中 鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因 序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的 表达情况
• 探针(Probe)：是带有标记物且序列已知、用于鉴定 互补序列的单链核酸片段
根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：
张固相膜上可以分析多个样品 • 缺点:特异性不高,不能分析样品的分子量
斑点杂交和狭缝杂交
• 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪 或直接点样）
• 优点：简便、快速、灵敏、样本用量少 • 缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性
NCF
点样板
96孔
滤纸
支撑板
12×8
至真空泵
废液储槽
四、组织原位杂交(in situ hybridization)
一、探针种类
1·基因组DNA探针（最常用的DNA探针） • 多为某一基因的全部序列或部分序列 2·RNA探针 • 杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强 • 非特异性杂交较少、低本底 3·cDNA探针 • 不含内含子等非编码序列，特异性高，研究基因表达 • 不易制备 4·寡核苷酸探针 • 根据已知核酸序列人工合成的DNA探针;分析点突变 5·锁式探针 • 一种特别设计的DNA探针，中间为连接序列 6·实时定量PCR探针
第三节 固相支持物与印迹
一、固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙烯二 氟(PVDF)膜和活化滤纸
1·硝酸纤维素膜 • 结合量大、本底较低、操作简便 • 结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆 2·尼龙膜 • 韧性较强，不易破裂 • 中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜
二、印迹方法
第四节 常用核酸印迹杂交技术
• 把组织切片进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后 置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与DNA或 RNA杂交
• 以cDNA为探针检测与其互补的mRNA在细菌或其他真 核细胞中的位置，称为RNA原位杂交，是分析基因表达 的常用方法
• 不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸 的组织、细胞、亚细胞甚至染色体定位
预杂交
制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
wk.baidu.com
一、DNA印迹法
1.样品制备；2.电泳分离； 3.变性； 4·印迹； 5·固定； 6·预 杂交；7.杂交；8·洗膜；9·分析
放射自显影照片
二、RNA印迹法
• RNA印迹法分析的待测核酸是RNA • 与DNA印迹法基本一致，所不同的是:
的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便 • 印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的
第二节 探针与标记
• 合适的探针具备以下条件: ①具有高度特异性，只与待测核酸杂交。因此，通
常首选编码序列制备探针 ②为单链核酸，用双链核酸制备的探针使用前要先
变性解链 ③带有标记物，标记物灵敏度高而稳定，检测方便