褐化、白化、玻璃化、黄化的现象的解释

do:i 10. 3969 / j. issn. 1673- 2006. 2010. 11. 019

植物组织培养中的常见问题与对策

王桂荣

(宿州职业技术学院, 安徽宿州市234000)

摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的,

加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消

毒, 可大大降低污染率。培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可

使畸形胚转化为正常苗。培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强

光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植

体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,

正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。

关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗

中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04

收稿日期: 2010- 04- 10

作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要

从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。

植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。

1. 1污染产生的原因

污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌, 导致培养失败。造成污染的原因有多种, 培养环境不清洁, 母株预处理不当, 外植体灭菌不净,培养基受菌污染, 实验所用仪器消毒不彻底, 操作程序不当等都会造成污染。细菌污染的主要特征是培养材料周围出现粘液菌斑或培养基中出现混浊雾状痕迹, 主要由外植体、操作器具、培养基灭菌不严引起。真菌污染的特征是菌斑呈绒毛状、絮状, 有不同颜色的孢子, 多由如操作不慎真菌孢子从瓶口落入造成污染。另外还有内生菌造成的潜伏性污染[ 1] 。

1. 2防止污染的对策

1. 2. 1严格消毒, 规范操作程序接种室、超净工作台、培养室要定期消毒, 培养室相对湿度控制在70% 左右。室内污染源主要是空气中

的真菌和细菌, 可用75% 的酒精室内喷雾,也可用高锰酸钾和甲醛混合熏蒸。接种前用70%的酒精擦洗超净工作台, 并且打开紫外线灯照射30分钟, 保证超净工作台处于无菌状态。严格无菌操作, 接种工具全部消毒, 接种人员自身要全面消毒等。每次操作都要用酒精灯烧烤接种针, 在操作过程中, 尽量不说话, 头部不要伸入操作台内, 快速完成接种过程。

1. 2. 2外植体和培养基的灭菌

在组织培养过程中, 选择不易污染且易表达全能性的外植体是成功建立组织培养体系的决定因素之一, 所取外植体材料为较幼嫩的茎、叶时, 可先将材料用清水冲洗干净, 用吸水纸吸干, 再以70% 的酒精浸泡, 无菌水冲洗后, 用2% ~ 10% 的次氯酸钠浸泡。如李慧等在草莓茎尖组织培养中比较了5种不同灭菌方法: 漂白粉饱和上清液浸泡材料15~ 30分钟, 10% 次氯酸钠浸泡10 ~ 15分钟, 10% ~ 12%过氧化氢浸泡10~ 20分钟, 5% ~ 10% 新洁尔灭溶液浸泡10~ 15分钟, 0. 1% 的升汞浸泡8~ 10分钟。实验结果表明, 前4种灭菌剂安全性较高, 但灭菌时间长, 往往会使接种材料的表面氧化褐变; 升汞杀菌效果较好, 但浸泡时间长会造成材料中毒。因此, 根据外植体材料的不同把握好不同灭菌剂的灭菌时间和使用浓度至关重要。外植体切割时, 把消毒后的外植体分成3份放在不同的无菌培养器皿中防止交叉污染。以茎尖作为外植体时, 在无菌条件下对枝条进行暗培养, 待抽出黄色的新芽时, 再采下芽作为外植体, 可明显减少污染。外植体经流水冲洗后, 在2~ 4的低温下处理1 天左右, 可用0. 3% ~ 0.6% 次氯酸钠或0.

1% 升汞消毒。接种于只含蔗糖的琼脂培养基上培养1周, 使组织培养中的酚类物质渗入培养基中, 取出外植体用0. 1% 漂白粉溶液浸泡10分钟, 转移到合适的培养基上培养, 可大大降低污染率。对于难消毒的材料如种子, 可用0.2% 的升汞消毒3~ 5分钟或用5% ~ 10% 的次氯酸钠浸泡25~ 30分钟。赵永辉[ 2] 等对结缕种子, 先用70%酒精浸泡, 再用5% 次氯酸钠浸泡20分钟, 消毒效果较好。对于有茸毛、表面粗糙不平的材料可先用70% 的酒精浸泡, 或在消毒剂中加几滴表面活性剂吐温80, 吐温80促使灭菌液充分接触材料表面, 以达到充分消毒的目的[ 3] 。针对潜伏性污染,外植体经过消毒后, 放在不含激素和维生素的培养基中, 培养一段时间后取出再消毒。对内源细菌污

染严重的外植体, 可在培养基中加入0. 3% 的丙酸钠等杀菌剂有较好的效果。李颖[ 4] 等的研究证明,继代培养中只有真菌污染, 采用3% 的多菌灵浸泡30分钟可灭菌。任敬民等在台湾青枣的组织培养中, 先用600倍的多菌灵喷洒, 经30秒75% 酒精消毒后, 再用0. 1% 升汞加几滴吐温80 消毒5分钟,既能减少污染又能促进外植体愈伤组织生长[ 5 ] 。对培养基采用微波间隙灭菌法, 微波灭菌具有成本低、效率高、处理后无污染等特点。减少培养基中的有机成分或在培养基中加入适当的青霉素、链霉素等抗生素, 可防止污染。

2畸形胚

2. 1出现畸形胚的原因

体细胞胚胎在早期发育时出现畸形, 形态和生理功能都出现异常, 不能育成苗, 或移栽不能成活的现象叫畸形胚, 如联体胚、子叶畸形胚、