NCCLS_EP6-A定量测量方法的线性评价_中文翻译

EP6-A
ISBN
Volume 23 Number 16 ISSN 0273-3099
Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures:
A Statistical Approach;Approved Guideline
EP6-A：定量测量方法的线性评价：一种统计学方法，批准指南
NCCLS…
通过自愿一致化的方式为世界医学科学团体服务
NCCLS是医疗领域一个非赢利性的，不同学科之间，自愿参与的促进标准化和建立指南的教育组织。

NCCLS创建于1968年并获得美国国家标准研究院的认可。

NCCLS所依据的原则是，对病人高质量服务所需的临床实验室检测，自愿一致的标准是必不可少的。

NCCLS通过各临床实验室、检验团体学会、工厂和政府机构的参与而代表临床检验界。

叙述了文件叙述了实验室的程序、常规和参考方法以及评估方案可应用于所有检验学科。

文件审核的一致化过程由一些正式的步骤组成，叙述了NCCLS文件和规范的编制如何发展到被接受为临床实验室标准。

出版物
NCCLS文件以标准、指南、委员会报告出版。

标准：通过一致化过程形成的文件，并对材料、方法、或实践以不能修改方式明确规定其特定的基本要求。

此外，标准也可以包含明确规定的选定要素。

指南：通过一致化过程形成的文件，叙述了用于临床检验界的一般实验操作、方法或材料的规范。

使用者可以使用成文文件或修改指南以适应特定的需要。

报告：没有经过一致化审定过程的文件，由理事会颁布。

“标准”一词，除了有特定含义外，还常用来指有关的NCCLS文件。

一致化过程
NCCLS的自愿一致化审定程序是一个为以下方面建立正式规范的方案：
1.标准项目的权威性
2文件的编制和公开评审
3根据实验室使用者反馈的评论修改文件
4文件被接受为临床实验室标准
大多数NCCLS文件必须有“建议”和“批准”两种层次的一致化文件，根据特定的一致化过程，文件也可以有一个中间（“试行”）一致化的水平层次。

建议：NCCLS文件作为建议标准或指南处在被临床检验界评审的第一阶段。

此文件需要接受广泛彻底的技术审核，包括对范围、方法、用途和逐字逐行对技术和行文内容的全面评审。

试行：只有当一种推荐方法对某一领域的评审有明确的需要，或者当某一建议性方案需要收集特定的数据时，才制定试行标准或指南。

它应该接受评审以保证其有效性。

批准：批准的标准或指南已在临床检验界得到一致同意。

应审定并评价最终文件的用途，以保证获得一致同意（即对以前版本的意见已圆满解决），并确定对其它标准的需要。

NCCLS 标准和指南为良好实验室实践（GLP）提供了一个一致化的意见。

NCCLS标准和指南的条款较之应用规定多少要严格些。

因而，遵守这些自愿一致性标准（或指南）不能减轻使用者对遵守应用规定的责任。

评论
实验室使用者的评论对一致化过程是很重要的。

任何人都可以提出评论，根据一致化过程由书写文件的NCCLS委员会记录下所有评论。

在下一层次文件出版时，这些评论或者修改了文件或者委员会在文件附录中给以反馈。

强烈鼓励读者以任何形式、在任何时间对任何NCCLS文件提出评论。

评论寄往NCCLS行政办公室：940 West Valley Road, Suite 1400,Wayne,Pennsylvania19087,USA。

自愿参与
强烈希望各专业的实验室科学家能自愿参加NCCLS项目。

请与NCCLS行政办公室联系以取得有关参加委员会的更多的信息。

目录
摘要 (i)
委员会成员 (iii)
前言 (vii)
1范围
2介绍
2．1 目的
2．2 选择方法
2．3 定义
2．4 实验方法的概述
3时间要求
3．1 仪器熟悉阶段
3．2 实验阶段
4实验条件的评价
4．1 样本要求
4．2 基质效应
4．3 可接受的基质体系
4．4 样本中添加物的选择
4．5 分析顺序
4．6 分析范围
4．7 样本准备和浓度计算
4．8 数据收集
4．9 临床上几个重要的浓度水平
5 线性范围验证—数据评估
5．1 初步的数据检查
5．2 离群值检查
5．3 线性范围的确定
5．4 考虑随机误差
6 线性范围发布
6．1 图表方法
6．2 发布线性范围的确认
6．3 允许误差与设定目标6．4 其它误差的影响
6．5 假设
6．6 发布线性声明的指导方针文献
附录A 样本稀释方法
附录B t值表
附录C 举例
相关工作组和评论摘要
相关工作组和委员评论摘要
质量系统方法
相关NCCLS出版物
前言
当某分析物浓度或活性的测量值与真值成数学上的直线关系时，我们认为这种定量测定方法是线性的。

对于分析和临床实验方法来说，线性特征是非常重要的。

线性关系代表一种最简单的数学关系，使分析物的结果测量变得简单而容易。

曾有争论，对于竞争免疫法这类测量方法来说，线性不是必须的，因为测量方法的响应物与浓度之间本来就呈非线性关系。

然而，响应物的剂量效应曲线可以通过合适的转换变成数学上的线性关系，而且对于一种分析方法来说，只有两点之间呈线性关系时，才能进行计算结果。

确保分析方法呈线性在临床上也是很重要的。

临床医生清楚某分析物量与患者的病理生理过程并非呈线性，但是他们非常希望实验室报告的结果与该分析物的真实浓度水平或数量或活性是呈线性关系的。

例如，当一个样本中分析物的量多一倍时，临床医生期望其测量值也是翻倍的。

本版本说明：
与以前版本相比EP6-A最大的改变是统计学方法的改进。

第一版EP6-P仅用线性失拟误差检验（LoF检验）来判断线性关系。

在本标准中，分析时选取五个等间距的不同浓度水平的分析物，每个浓度水平测量四次。

回归线由所有点所得，同时得到两个方差即：由重复测量得到的样本方差和由五个平均值的回归线得到的均值方差。

这些方差的比值即为LOF检验的基础。

这种方法的缺点是精密度好的检测系统有很小的样本方差，在LOF检验的比率中，均值方差很小时，得出在统计学上差异显著，即呈非线性。

也可能（概率很小）由于样本方差很大（重复性差）而导致临床上很重要的非线性得出相反结果。

EP6-A的多项式回归在概念上与最初的LOF检验非常相似。

它们都有两种统计模型（线性与非线性），都是评价那种是最可能的模型。

然而，EP6-A作为一种多项式回归方法，是一种非线性选择的特殊参数模型，特别能够很好地鉴别非线性。

精密度与线性成比例关系。

精密度好时有利于判断线性关系，精密度差时则不利于确定线性关系。

这种方法可以：1）在每个水平上判断非线性度，2）在评价非线性时可以控制不可接受的精密度，3）提供一种可测试的统计模型，4）在很多软件上可以进行编程。

在以前的版本中也提到过，评价线性关系时，首先必须在图上点上数据。

通过目测有助于判断使用哪种统计学方法和是否具有线性关系，非线性度是否与预期的目标相近。

术语注释
美国临床实验室标准化委员会（NCCLS或CLSI）作为全球标准化的领导者，正努力使全球各种标准尽可能协调一致。

协调一致是一个在认知、理解、解释差异各方面逐步达到全球一致的过程。

NCCLS认识到医学术语在美国、欧洲和其他地方表达不一致，这些不同也表现在NCCLS、
国际标准化组织（ISO）和欧洲标准化委员会（CEN）的文件中。

因此NCCLS认识到医学术语的统一有利于全球标准化的统一，应得到立即重视。

这项政策的实行是一个发展和教育的过程，从一些新项目和现有文件的修订开始。

为使ISO与NCCLS在一些术语上保持一致，下列术语用在EP6-A文件中：Trueness(准确度)指多次测量的平均值和分析物的真实值的接近程度。

Repeatability(重复性)代替批内精密度，可以恰当地用来描述在一定条件下连续测量同份分析物的接近程度。

Measurement procedure(测量程序)代替Analytical method(分析方法)，指一系列用给定的方法完成的特殊操作。

Measurement range(测量范围)代替Reportable range(可报告范围)，指测量误差限定在一个特定范围内的分析物测量的一系列值。

Measurement error/error of measurement(测量误差)代替total error(总误差)，指测量值与真值的差值。

所有的术语和定义为了能得到更广泛的应用，在下一次的版本中将再一次修正。

标准防护
由于不知道何种标本有传染性，因而所有的人体的血液标本都被当作有传染性，操作时都要按标准防护执行。

标准防护是一种新的防护指南，主要强调全身防护和与身体隔离的原则。

标准防护是防止所有的病原体，比仅防止血源性病原体更广泛。

标准防护和全身防护指南见美国CDC文件和NCCLS M29---保护实验室员工避免职业性感染。

关键词：允许偏差，允许误差，线性，基质效应，测量误差，总误差，不确定度
定量测量方法的线性评价
一种统计学方法，批准的指南
1．范围
本文件提供一种建立、验证和/或证实定量测量方法线性范围的操作方法，它不能鉴别非线性的原因，用更多的样本数，可以更可靠地判断线性关系。

如果一个线性评价失败，要求重做，可以用更多的重复次数，或减少样本数而缩小线性范围。

本指南主要是评价线性关系，尽可能不受精密度和准确度的影响。

精密度很差时，会妨碍线性关系的评价，因而重复性的检查也包括在内。

实验过程中会用到一些基质，尽可能与分析标本的类型一致（血清、血浆、尿液等）。

本指南要求实验室设定非线性误差的目标，只提供基本概念，没有特定的要求。

2．介绍
2．1 目的
本指南的目的旨在提供一种定量测量程序线性评价的统计学方法。

首先要确定一种方法的非线性浓度范围，及在每个浓度水平上非线性的程度。

本指南强调任何用户有必要确定自己对线性程度的要求，或非线性的允许误差范围。

评价线性覆盖范围的Global 检验（如LoF检验）不是特别重要。

Global 检验仅仅表明统计学上的非线性存在，不能显示非线性存在哪里，也不能显示误差的大小。

线性试验有助于评价偏倚的大小（但非线性并不是偏倚的全部），偏倚是测量误差的一部分。

用户必须定一个目标，确定自己所要求的测量误差、偏倚、随机误差（不精密度）、非特异性（干扰）的大小。

EP-6A仅仅是指导用户的一系列方法评价文件中的一种，请参照最近发布的EP-21文件---临床实验方法的总分析误差。

本文件适用范围很宽，当需建立一种方法的线性范围时，我们需要测试一个很宽的分析浓度范围，然后逐渐缩小直到有可接受的线性范围。

如果用户在自己的实验室要验证已知的线性范围（厂家提供），测量时仅覆盖该范围即可。

操作方法大体相似，不同的仅仅是分析的浓度水平和重复的次数。

2．2 方法选择
有很多的方法用来评价线性范围。

Kroll和Emancipator提出一种基于直线回归方程与多项式方程比较的方法，用残差（即每一个数据点到回归直线的差值）来定义线性。

这种方法的优点是非常可靠，且基于严格的科学原理。

如果得出线性适合（一次多项式）则说明测量方法是线性的。

但这种方法并不简单，用户必须对实验数据（多用表格设计）进行多次多项式回归。

这种
方法被Kroll、Praestgard、Mechaliszyn和Styer进一步改进，并被美国病理学家学会实验室间方法比对所采用。

Krouwer和Schlain提出一种通用的方法，即LPO（last point off the line），需要多次计算最小二乘法方程。

Tholen提出一种图解连同回归线性失拟误差与目标百分比对比的评价方法，对连续线性片断进行简单的斜率分析。

2．3 定义
允许偏差/误差(Allowable difference/allowable error)：在一个检测系统中，来自各种因素的，用户能够承受并能满足医学要求的分析偏差的大小。

通常单次检测的允许误差的范围用标本测量靶值±允许误差来表示。

分析物(Analyte)：具有某一名称的定量测定成分（ISO FDIS 17511）
分析结果（Analytical result）：在本文件中指一个试验标本的最后测量结果。

大多用浓度或活性表示。

偏倚（Bias）：测量值与公认参考值之间的差异。

注：一般情况下，偏倚指公认的方法（决定性，参考性或指定方法）与比较方法的测量结果的差值，用数值或百分数表示。

自变量（Input variable）：非独立变量（independence variable），与因变量（output variable）相对应，用X表示，它的值点在X轴上。

截距（Intercept/Y intercept -1）：表示一个函数与数轴的交叉点，当一个变量为0时另一个变量的值。

如y截距表示当x为0时的y值大小。

最小二乘法（Least square regression）：一种统计学方法，由所有数据点得到的直线或曲线上每个点到X轴（即与Y轴平行）的垂直距离的平方和达到最小。

线性方程（Linear squation）：代表线性关系的方程式，典型的线性关系方程表达式为：Y=a+bX，X和Y分别为自变量和应变量，b为斜率，a为Y轴截距。

线性范围（Linear range）：在本指南中，指覆盖检测系统可接受线性关系的范围，非线性误差小于设定标准。

线性（Linearity）：在检测样本时，可以直接按比例得出分析物含量（一定范围内）的能力。

线性回归（Linear regression）：待测变量（非独立）的浮动经常可以（部分地）归因于其他变量（独立），回归的方法量化了独立变量和非独立变量之间的关系。

线性回归其因变量与各回归参数之间为线性关系。

测量误差（Measurement error）：测量结果减去真值（或公认的参考值）的大小。

测量程序（Measurement procedure）：一系列操作规程，根据给定的方法，用于特定的检测。

测量范围（Measurement range）：指测量仪器的误差在特定范围内的一系列分析物的测量结果，以前称为可报告范围。

应变量（Output variable）：独立变量，与自变量相对应。

多项式回归（Polynomial regression）：不同阶别的多次最小二乘法回归
Y=a+b1X 一次多项式或者拟合直线
Y=a+b1X+b2X2 二次多项式
Y= a+b1X+b2X2+b3X3 三次多项式
重复性（Repeatability）：(测量仪器)在相同的测量条件下，对同一样品多次测量，测量仪器重复给出十分相近示值的能力，重复性可以用示值的离散特性定量表示。

必须在相同的测量程序、相同的仪器设备、相同的位置、在较短的时间内重复等。

回归标准误（Standard deviation of y about a regression/standard error of regression，SDy,x)：独立变量Y与预期变量X相对应的可估计变量Y’平均值之间的差量检测大小。

检测系统（Testing system）：包括测量过程的所有因素，如仪器、样本、人员、试剂、辅助材料和操作等，也包括样本类型、测试温度、湿度等。

准确度（Trueness）：一组连续测量结果的平均值与公认参考值的接近程度。

准确度一般用测量偏倚（数字）来表示，准确度与偏倚呈相反关系。

2．4 实验方法的概述
本指南所用的多项式回归最初由Kroll等提出，有严密的统计学规律，且容易用表格来完成。

可以参考一般的统计学文献、书籍或统计软件。

多项式评价线性首先假设数据组呈非线性，所有数据点能用直线或曲线的数学方程来表达，随机误差在可接受范围内，则不论最适曲线是直线与否，都不影响（线性范围内）实验数据点之间其他浓度反应状况，并能得到连续可靠的结果。

收集数据时要求有5到9个不同浓度的标本多次测量，不同的浓度标本之间稀释关系已知，不要求各浓度之间呈等距的。

本质上，多项式回归是设计用来评价曲线的反应模型，因而它适合于评价非线性。

这种方法由两部分组成，第一部分是检查非线性模型是否比线性模型更适合于数据组；第二部分是评价最适非线性模型与线性模型的差值（每个点）是否小于该方法所允许的偏差。

3．1 熟悉仪器设备
评价分析程序的实验室人员必须十分熟悉仪器的操作、质量控制和定标方法，以及正确的收集样本等，厂商提供的培训是非常有用的。

仪器设备在实验室必须安装和使用一段时间，实验室人员能理解和正确操作仪器。

3．2 实验时间
全部实验数据尽可能在较短的时间内收集，如可能，单个分析试验最好在一天内做完。

4．实验条件评价
建立一个检测系统的线性范围比验证线性范围来说，所需的实验条件是不同的，前者需要更多的实验标本和重复次数，后者只需一系列已知浓度或相互间稀释关系的标本，测量顺序都是随机的。

4．1 标本要求
线性评价实验要求有足够量的标本，要能满足五个或更多浓度标本的稀释和测量。

当验证线性范围时，需要5到7个能覆盖整个线性范围（厂家提供）的不同浓度的标本，每个浓度水平测量两次。

当一个新的测量方法（或厂家或实验室改良一个实验方法时）需要建立新的线性范围时，需要7到11能覆盖预期的测量范围的不同浓度的标本。

生产商希望有更多的测量点（比预期的线性范围宽20～30%），这样能检测到“拐点”，就能确定更宽的线性范围。

根据不精密度的大小，每个浓度水平测量2～4次。

五个测量点是多元回归方法评价线性范围时的最低要求，更多的测量点能更精确的评价线性，得到的线性范围更宽。

本指南推荐用高值和低值浓度的样本按比例精确配成等间距的不同浓度样本，但等间距不是本方法所必需的。

只要各标本间的相互关系已知，配成特殊浓度的样本也是可以接受的。

在本评价实验中，在实验室内用移液管精确地吸取高低值浓度标本配成的混合物的误差比单个的称量法配制不同浓度的标本的误差要小。

在吸取小容量标本时要小心，用正位移液管比较有用。

5到11个浓度水平的等间距标本的配制方法见附录A。

如果用到商品化的体外诊断试剂，需将厂家附上。

在全自动、半自动和手工化学操作系统上，这些试剂可用于定标、验证测量范围和线性等。

4．2 基质效应
用于验证线性范围的标本类型应与临床测试所用的标本类型相类似，所有标本应不含厂家所标定的干扰因素（如溶血、黄疸、脂血等）。

如果上述条件不可避免，则应在最后的报告中注明在评价实验中所用的标本处理方法或基质类型。

注意：标本处理时加入不同的掺杂物，与人的标本相比，会造成不同的影响。

4．3 可接受基质体系
如果多种基质标本类型（如尿液、血清、脑脊液、全血等）在实验中用到，则应评价每种基质类型。

请参考最新版本的NCCLS的EP14文件—基质效应的评价。

以下为可能用到的样本类型，注意在一些特殊方法时要选择合适的基质。

病人标本
理想的样本类型是病人的标本，用接近于预期的可报告范围上限和下限（或测量低限）的两个分析浓度的标本配成所有标本浓度。

由于我们测定的病人标本的最终浓度代表验证的范围，因而最后的高和（或）低值浓度需要调整才能达到期望的范围。

用推荐的稀释液稀释病人样本
用于稀释病人高浓度样本的液体对测量结果是有影响的，只有厂家推荐的或实验室已证实可用的稀释液才能用于稀释样本。

对于有些分析系统来说，允许用病人的标本稀释法来评价线性，可用经认可的稀释液来对超过分析范围的病人标本进行稀释，这时需提供材料证明该稀释液是可用于该分析系统的。

如可能时，厂商建立分析系统时，应包括稀释液的研究。

可能情况下，生产厂家在制定测量方法时要考虑到稀释液的研究。

病人样本中添加分析物
当分析物中不含干扰物时，添加的分析物不需要高纯度。

当存在干扰物时，在报告中需提及其来源、纯度、预期影响等。

如果含分析物的浓溶液加入病人标本中时，加入量尽可能少（原则上少于总体积的10%），并记录溶剂。

用低浓度或者处理过的标本物质稀释样本
如果可能，用低浓度的病人标本。

做为选择，可以适当地处理病人标本以降低分析物浓度（如透析、热处理、层析）。

注意这些处理可能改变分析物或基质的物理或化学特性。

尤其重要的是保持恒定的基质要好于通过稀释得到低的基质效应。

商业质控物/定标物/线性物质
如果用到这些物质，同病人标本一样进行分析，可以用高值和低值标本进行混合得到中间浓度。

要注意分析物要保持正常生理状态下的形式（如蛋白结合或代谢产物状态）。

用盐水或其它稀释剂而不是推荐稀释液
如用到这些稀释液，注意基质效应可能会影响到检测结果。

这些稀释液要用最小量，并可以查证其可用。

低稀释/过稀释商业质控物
如用到这些稀释液，注意基质效应可能会影响到检测结果，而且随浓度的不同而改变。

这些稀释液要用最小量，并可以查证其可用，同时要保证质控物完全溶解。

水溶液
当用水溶液时，对分析方法的响应曲线的影响未测试，基质效应可能影响到响应曲线和结果的解释。

尽管高纯度的材料可以最大程度的减少干扰效应（影响结果的解释），但低纯度的材料也可以接受。

大量的常规临床生化方法的定标都是用水溶液材料，称量法可用来确定靶值。

其它溶剂
当用有机溶剂作稀释剂时，基质效应可能更大。

制成分析样本的添加物的选择
选择添加物时要仔细考虑，使用其它物种来源的原料也会引起一些影响。

表1为一些分析物的建议原料，仪器或试剂厂家的建议也可能有助于确定合适的材料。

表1 样本添加原料
4．5 分析顺序
分析顺序应是随机的，但如果存在明显携带污染或漂移，则可妥协。

4．6 分析范围
选择的测量浓度范围应包含或等于厂家所声明的最低和最高浓度范围，如果声明的线性范围或测量范围与选择的浓度范围不一致时，可以选择合适的样本浓度加做新的实验，或舍去未端点适当地缩小线性范围（五个或以上的样本数）。

当建立方法的线性范围时，需7到11个样本，且20%到30%的样本的浓度范围超出预期的测量范围，在可接受的线性响应范围内，试图舍去非线性点，可得到较宽的线性范围。

4．7 样本准备和浓度计算
如果高值和低值浓度是未知的，每一管必须编号来确定它的相对浓度。

对于等间距浓度来说，每管可以用整数（如1，2，3，4，5等）来分配号码，也就是说，每一管的的浓度分析前可以未知。

验证线性范围时，高值和低值的测量均值要用到。

如果中间分析管的浓度不是等间距的，相邻管之间的相互关系一定是已知的。

也可以先用高值和低值浓度配制成一个中间浓度管，然后用低值和中间浓度、高值和中间浓度分配其它管的浓度。

以下以五个浓度等间距的配制（参考附录A：5到11个等间距浓度的分配方法）举例。

在一些实验室，优先考虑称量法来配制溶液。

不管用何种方法准备低高值溶液，操作时要小心、谨慎。

（1）高值和低值浓度管要用可以接受的基质，要满足整个实验过程中的用量，具体量的多少要依赖于分析中所用体积决定。

注意在操作过程中，要有最准确和精确的加样技术。

下面为等间距分配各管浓度。

（2）低浓度（理想状态为接近或位于线性范围下限）管编号为1，高浓度管编号为5；
（3）中间浓度管由高浓度和低浓度管按恒定的间距配成不同的浓度，一种简便的配制中间浓度的方法如下：
第2管为3份低浓度和1份高浓度标本混合而成；
第3管为2份低浓度和2份高浓度标本混合而成；
第4管为1份的低浓度和3份的高浓度标本混合而成。

每管的浓度由以下公式来计算，第1管的浓度为C1，体积为V1，以此类推，第5管的浓度和体积分别为C5和V5：
浓度C=（C1·V1+C5·V5）/（V1+V5）
每管的浓度和体积单位必须一致，注意每管要充分混匀，并防止蒸发或其它改变。

如当检测系统每测试需要反应体积为，每浓度水平测量2次，则至少需且还须考虑反应死体积。

高浓度管浓度为120单位，低浓度管浓度为40单位，注意测量前不需知道实际浓度。