总皂苷含量测定的方法学验证

总皂苷含量测定的方法学验证

试剂：Amberlite-XAD-2大孔树脂Sigma化学公司 U.S.A.

中性氧化铝层析用 100-200目

人参皂苷Re 购自中国药品生物制品鉴定所

正丁醇、乙醇、高氯酸、冰乙酸分析纯

香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸并定容至100ml。

人参皂苷Re标准溶液：精确称取人参皂苷Re标准品0.020g，用甲醇溶解并定容至10.0ml，即每毫升人参皂苷Re2.0mg。

实验步骤：

供试品溶液：（1）试样处理：吸取2.0ml试样于25ml容量瓶中，加水定容至刻度，取1.0ml进行柱层析。

（2）柱层析：用10ml注射器作层析柱，内装3cm Amberlite-XAD-2大孔树脂，上加1cm中性氧化铝。先用25ml70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25ml水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0ml以处理好的试样溶液，用25ml水洗柱，弃去洗脱液，用25ml70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干。以此作显色用。

（3）显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2ml 5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8ml高氯酸，混匀后移入5ml带塞刻度离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0ml，摇匀后，以1cm比色池于560nm波长处与标准管一起进行比色测定。

对照品溶液（4）标准管：吸取人参皂苷Re标准溶液（2.0mg/ml）50μl放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），或热风吹干（勿使过热），以下操作从“3.2 柱层析”起，与试样相同，测定吸光度值。

空白溶液（5）空白溶液：吸取甲醇溶液50μl放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），或热风吹干（勿使过热），以下操作从“3.2 柱层析”起，与试样相同，测定吸光度值。

1.确定最大吸收波长（波层扫描）

精密量取对照品溶液于1cm吸收池中，以空白试剂作参比，在分光光度计上从波长42-650 nm，每隔10 nm测定一次吸光度。

2.线性关系考察——标准曲线的制备：

分别紧密量取10、20、30、40、50、60、70μl对照品溶液，吸取人参皂苷Re标准溶液（2.0mg/ml）50μl放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），或热风吹干（勿使过热），以下操作从“3.2 柱层析”起，与试样相同，测定吸光度值。以吸收值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3. 专属性试验：

阴性样品：辅料+无皂苷的中药

供试样品

4.精密度试验

4.1重复性

在同一批样品中取2ml样品6份，分别按照上述方法配制成供试品溶液，测定吸光度值。

4.2 中间精密度

不同日期，重复操作重复性试验。将重复性实验数据合并，共12个数据分析RSD值。

5. 稳定性试验

取供试品溶液适量，按照测定法测定吸光度值，分别在0、2、4、6、8h各测定一次。

6. 准确度——加样回收率

精密称取样品9份，每份1ml，精密称定，置于25ml容量瓶中，分别加入不同量的人参皂苷Re标准品溶液（分组如下表），加入蒸馏水至刻度，摇匀，制得3组不同浓度的供试品溶液，按照测定法操作，测定吸光度值。

7. 十批样品测定

取十批样品，制备十批供试品溶液，每批供试品溶液重复测定2次