农杆菌转化

农杆菌介导的高效玉米遗传转化体系的建立

摘要: 为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系, 对影响玉米胚性愈伤组织

诱导的11 个因素及影响胚性愈伤分化的9 个因素用正交实验方法进行研究Southern blotting 分析表明, 25 mg/L 潮霉素选择压下抗性愈伤率作为转化体系优化指标是可靠的。在影响转化效率的因素中, acetosyringone (AS)使用浓度因基因型不同而表现出敏感度差异, 共培养温度24~25℃、农杆菌浓度和浸泡时间0.7 OD×15 min, 以及pH 值5.5~6.2 是最高转化率的优选组合。

关键词: 玉米; 正交实验; 胚性愈伤诱导率; 抗性愈伤率; 农杆菌介导;

玉米是重要的粮食和饲料作物, 其产量直接关系到我国粮食安全问题。然而, 玉米产量与品质长久以来徘徊不前。尽管农杆菌转化法具备能导入大片段外源基因且低拷贝整合、不易引起分子间或分子内重排等优势, 但玉米等单子叶植物非农杆菌天然宿主, 遗传转化率低[2], 即使获得少量转基因植株也因遗传稳定性差、基因表达水平低及嵌合体等问题而限制了对后代的选择和利用。目前玉米遗传转化体系研究大多集中在单因素对遗传转化率的影响分析上。这包括自交系筛选[12~14]、受体材料选择[15~17]、培养基调适[18]、载体系统优化[19]、辅助转化[20]、筛选标记[21~23]及标记剔出[24]等, 也获得了一些有关玉米产量[25]、品质[26~28]及抗性(抗虫、抗病、抗寒和抗旱)[29~33]等性状改良的研究结果。进一步关于农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展可参阅Shrawat 和

Lörz [34]、魏开发等[35]的综述。本研究拟先建立基于优良自交系的高频再生系统, 然后对影响遗传转化效率的主要因素进行分步优化, 试图为玉米遗传转

化体系研究提供资料。

1.胚性愈伤组织诱导因素正交实验

取人工授粉后9~12 d 的雌穗, 4℃冰箱存贮3~4 d, 室内去苞叶, 用70%酒精擦拭表面, 再用0.1%HgCl2 浸泡5 min, 无菌水冲洗4~5 次, 用刀片切去3/5 籽粒, 取同一部位长度在 1~2 mm 范围内幼胚, 盾片朝上分别接种于计划表50 个处理。每处理30 枚幼胚, 3 次重复, 共计4500 枚幼胚, 15 d 继代1 次, 温度27℃, 光照12 h, 6周后统计胚性愈伤组织块数, 计算胚性愈伤组织诱导率。按实验序号, 用Sigmaplot 和Minitab 15 软件计算标准差, 作显著性及主效应分析。表 1 愈伤组织诱导和分化基本培养基组成培养基代号培养基蔗糖(g/L)

水解酪蛋白(500 mg/L)L-脯氨酸(700 mg/L)维生素C(250 mg/L)

A MS 30 . . .

B MS 50 + + +

C N6 50 + + +

D MB 50 + + +

E NB 50 + + +

2.胚性愈伤组织分化因素正交实验

基于早期愈伤分化影响因素及效应浓度的筛选,用正交设计助手Ⅱv3.1 按照基

因型(黄早4、综31、金黄96B 及GY237)、培养基(B、C、D、E)、2, 4-D(0、0.1、0.5、1 mg/L)、6-BA(0、0.5、1、2 mg/L)、NAA(0、0.2、0.5、1 mg/L)、KT(0、

0.1、0.5、1 mg/L)、ABA(0、0.1、0.5、1 mg/L)、ZT(0、0.1、0.5、1 mg/L)及AgNO3(0、1、2、5 mg/L)顺序建立 L32(49)实验计划表(略)。将1.2.1 所获黄早4 的448 枚、综31 的480 枚、金黄96B 的320 枚和GY237 的224 枚胚性愈伤组织, 接种于L32(49)实验计划表的36 个处理上。每处理3 次重复, 温度25℃, 光照12 h, 6 周后统计分化率。按实验序号, 用Sigmaplot 和Minitab 15软件计算标准差, 作显著性及主效应分析。

3.GUS 基因超表达载体构建

从基础质粒pCAMBIA1391 中PCR 克隆GUS基因全长, 引入Apa I 和Swa I 酶切位点, 插入载体pCAMBIA1300-Super。获得转基因植株。按实验序号, 用Sigmaplot 和Origin 软件计算标准差,作显著性分析。

4. GUS 染色、PCR 及Southern blotting 检测

从黄早4 号和综31 抗性愈伤中分别随机抽取3组, 每组33 块(株)抗性愈伤或抗性苗(分化了的抗性愈伤以抗性苗为材料)进行GUS 染色和PCR 抽检。GUS 染色参见魏开发[36]的方法, 显微镜下观察GUS染色产生的蓝斑, 对照为转化pCAMBIA1300-Super空载体的抗性愈伤组织

。

5.结果

基因型对玉米胚性愈伤诱导有决定作用,高质量胚性愈伤组织诱导、继代、保持是基因型、培养基、激素组合、补充物添加、ABA 浓度周期性波动等多因素共同作用的产物。本实验筛选出两个因素组合, 一是综31 和改良MB + 2,4-D 2 mg/L +KT 0.2 mg/L + ZT 0.5 mg/L + 6-BA 1mg/L + ABA2* mg/L + L-谷氨酰氨 50 mg/L+ AgNO3 5 mg/L(No.9)组合; 二是黄早4 和改良MB + 2,4-D 1.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L + KT 0.5 mg/L + ZT 0.2 mg/L + ABA2* mg/L + 甘露醇5 mg/L + L-谷氨酰氨300 mg/L(No.29)组合。信号分子乙酰丁香酮(AS)与Vir 基因的活化密切相关, 合理使用浓度一直是研究者非常关注的问题。本研究分别以综31、黄早4 在胚性愈伤组织诱导培养基No.9 和No.29 上做平行转化实验。