几种酵母转化方法

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酵母转化原理：
Like Saccharomyces cerevisiae, linear DNA can generate stable transformants of Pichia
pastoris via homologous recombination between the transforming DNA and regions of homology within the genome (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989). Such integrants showextreme stability in the absence of selective pressure even whenpresent as multiple copies. Note that single crossover events(insertions) are much more likely to happen than double crossoverevents (replacements). Multiple insertion events occur spontaneously atabout 1-10% of the single insertion events.
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989).这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.
电转化注意点：
一、制备感受态的菌液收集时间：
1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！
2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或-80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

四、电转化注意点：
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。

）
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。

电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。

4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。

电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。

电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。

如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。

5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。

6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。

转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。

五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。

如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。

3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ulddH2O 重溶。

转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。

有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。

建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。

2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。

处理液：
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。

7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下：
1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；
2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。

4、将sorbital、水和菌液均冰浴；
5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul 冰sorbital；
6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；
7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。

9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。

做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、
2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。

1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。

菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD 值是否准确！
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50mlYPD中，培养大概18个小时吧。

OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。

2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。

）
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。

如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。

42度水浴一会，然后过滤除菌。

我没有加硫酸铵。

YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了
（关系不是太大）。

方法三：简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h 后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。

方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）
1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul
3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；
4.电击，1,5KV.使用的是Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。

5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。

将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；
方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清
(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟
(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。

(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。

方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。

⑵取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min 培养过夜，一般12小时左右。

⑶将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑷按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑸按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
⑹按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；
⑺ NOTE：可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。

化学转化
毕氏酵母氯化锂转化法
试剂
1. 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释
2. 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
毕氏酵母的转化
1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
5. 30℃水浴孵育30min；
6. 42℃水浴热休克20～25min;
7. 6000～8000rpm离心收集酵母菌体；
8. 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；
9. 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30'c培养至转化子出现）
毕氏酵母PEG1000转化法
试剂
缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol
缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存
注：1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;
2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;
待转化毕氏酵母的制备
1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;
2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；
3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；
4. 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；
5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，
6. -70℃保存
毕氏酵母的转化
1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；
2. 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；
3. 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；
4. 30℃水浴孵育1h；
5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；
6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；
7. 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；
毕赤酵母转化方法有4 种。

最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。

由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。

因此利用ZeocinR作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化。