碱裂解法质粒提取

戚农解法捉取血粒利用的足共价闭合环状隨純DNA吋线状的染色体DNA片段的们卜学I:的雄井来分离它们.在P H ift介干12. 0-12. 5 这个狹窄的范国内・线状的DNAXX螺旋结构牌开变件・共价闭坏质粒DNA的做他如然断裂•但两条互补谨彼此依然相互盘绕而紧纟炮结介在一起.^WApHI.S的酣酸钾簡盐缓冲液便闭拜低后.其价闭介环状的历林DXA的两条互补琏迅速而准确地芟件.而线状的染色体DXA的两条互补谥彼此已龙全分开.不能迅速而准确地更性•它心绸绕形成网状结构.通过离心.染色体DNA9不稳定的大分子RNA、蛋白ffi-SDS更合物彎一起沉淀下来.而质桂DM知留在上淸液中.

仪器、材料与试剂

仪器：恒温堵养箱、恒SA晞床、小型岛速离心机、岛斥灭肃锅.

材料：带有质枝的大肠杆菌

试剂：

Solution I

□Cmaol / L 匍荀椭

□rnnol/L 三疑甲基氮基甲烷(TMjTrx・HC1 (pHS. 0}

1.0 so] /L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pHS. 0)

Solution II

0. Inol/L NaOH. 2%SDS(十二烷雄晞酸钠).用前答体枳混合

Solution III

5rx>ol /L 钾 GO aL

冰乙酸11.3mL

水2S. 5mL

TB级冲液

lCmsol / L Tris • HC1

laizol/L EDTAipHS. 0)

WRNAttlRXAttA)

W RXA fftitt于 1 Cmaol/L Tris -HCKpHT.S). IZol/LhCl 中.配成 10之/丄的浓度.干 KXTC 加热 15min.缓慢冷却至室船.

保存于-20-C.

实!脸步曝（采用SDS碱裂解法小駅別备脈林DMD

1.大肠杆菌培养

2.捉取帧粒

3.质林的琼册輸凝胶电泳

实鮒操作步曝

I.将过夜培弊的2=1细繭.高速离心1分钟.彻，底去除上淸.

2•加入lOCtnl solution I.用枪头或抿荡话充分悬浮细茵・

3•加入200ml Solution IE立即上下颇倒或用手指弹管底・使细0B稷解.室温放立（2分钟左右）至藩液竇成蹄.

4.加入lOCtnl Solution III.立即上下硕倒5-10次.便Z充分中和.室温放立2分钟.

注总：步驟2和3在冰上探作效果更佳.

5.岛速离心・15,000转/分钟.10分计.无篙低盘炭心.

注世：捉岛离心速度・使沉徒更加紧密.步驟6操作取上淸更为方便.

6.取出A1样&收集訝和35柱・在管壁标上样胡号.将步驟5中的上淸全部转移到似或倒入）3S柱里.盖上离心管盖子.室昭放 ?12分俳（室盘放近时间不业要.可长可短〉：用台兀离心机室盘冊連〈12・000转/分钟）烫心1分忡.

注直转移上淸时不耍吸取沉淀.否则会出现Genoiric DNA和蛋F倾污染.

离心管盖子缶上时・柱子内斥的增加・可能会使部分溶液从柱子底器漁出・为正曲现欽.

7.取下3S柱.弃去掉收集管中的废液.将3S柱放入同一支收集管中•吸700ml W as h Solution到3S柱•离心1分钟.

s. 步骤7 一衣.

9.取下35柱・弃去惮收集管中的废液・将3S柱放入何一支收集管中.岛速离心2分钟.

10.将3S柱放入干净的1・5ml的离心营中.在3S柱子股中央加SOMITE或水.不要盖上离心管陰室爲下放M 2分佻孟上离心仔盖. 室隘岛速离心1分钟.

注童：将充戒水预想到50・C左右可以捉局洗脱效率.测用用历粒用30=1预羔的水洗脱.浓度•般满足测片:耍求.

II.洗脱的页杭可以立即用于各种分子生物学操作或70'C保存备用.1』过夜焰养细胞•欣粒如果用50"水洗轧通常情况下可以

取10nl洗脱液做Acaroze电泳戒酚切分析.

实验二农杆情介导的Ifl物19传转化

（练合设计实验〉

<-）实验目的

1.使芳生全而了解农杆繭介导的檢物转基因的方法：

2.使学生根棚已学的知识.在教师描导下设计一个农杆菌介导Ifl物的遗传转化实0方案：

3.使学生掌握农杆菌培养.檢初外IJU本无凿系建立・农HiStt染和转化体篩选零一系列试笛方祛.

（二）焙养基

1.LB培养基：每升含羊齐酵母段幵5 s，胰蛋白淼10匕.XaCl 5乙・PH 7.2

2.Y£B培养基：毎升含有：牛肉浸ff 3 s・醇母igff 1 S，蛋白腺5匕•岷椭5匕・耘S3 • H2O 0.5 c・PH 7.0

3.YEPffi^M：毎升含有：牛肉浸•膏10匕.酵毎捉取液10 s・NaCl 3 B . PH 7. 0

4・实生苗培1/2MS培养基.附加3O S和0.6%琼脂.PH二6.0・，

3.预培养如 MST.0~l.2ms L 2・4・»0. 2m匕I 6・BA・3g奁椭+6匕琼盼.PH=5. S・

6・分化培养基：XS*0. 2DB/L IAA*2. Cm C/L 6-BA-305能椭*6. 3C球耶+A品036叱 L・ PH=5. 8-

7.稀选焙养基，分化焙养呈+A匕血3 G=c. L*5CCm C/L Cb^l0«. L Kan. PH=5. 8.

（三）试验仪话

超级趙海L作台

智能气帳培菲箱

大型落地式高速冷栋烫心机

凝胶成像系统

台式密温高速离心机

立式灭菌锅

电泳相关设备

（四）农杆肃介导植初转化实崟步屋（以油菜子叶转化为例）

1.根癌农杆18的焙养