蛋白质与多肽类药物的研究及应用

重组DNA技术的一般过程
重组DNA医药产品
产 品
组织胞浆素原激活剂 血液因子VIII 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素 干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 白细胞介素 超氧化物歧化酶 单克隆抗体 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 抗凝 促进凝血 刺激造血 促进红细胞生成，治疗贫血 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤，免疫调节 激活、剌激各类白细胞 清除自由基、抗组织损伤、抗衰老 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 预防乙肝 预防霍乱
• 截至 2013 年，经美国 FDA 批准上市的单抗 药物共有 46 种，进入临床试验阶段的单抗 则接近220多种，治疗范围涵盖肿瘤、自体 免疫疾病、治疗器官移植排斥反应、抗感 染、止血、呼吸道疾病等，其中又以肿瘤 和自体免疫疾病药物市场最大，种类最多。
2013年全球十大畅销药物排名
2013年 通用名 Humira（阿达木单抗） Enbrel（依那西普单抗） Remicade（英夫利西单抗） MabThera（利妥昔单抗） Seretide Lantus（甘精胰岛素） Avastin（贝伐珠单抗） Herceptin（曲妥珠单抗） Crestor Abilify 主要适应症
• 有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶切 位点。
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
单克隆抗体
• 单克隆抗体是 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂 交形成的杂交瘤细胞产生的，其重链和轻 链所形成的结构域可以识别和结合特异抗 原。
细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
单链抗体scFv
• 通过基因工程设计，只编码抗体的重链可变区以 及轻（VH+VL），通过一段多肽连接，形成单链 抗体的可变区（scFv）。连接肽将VH 的C 端与VL 的N 端连接，反之也可以。它保留了抗体与抗原 的特异性，可以使用大肠杆菌表达。穿透力强但 往往亲和力下降。分子量~25KD。 • 现在FDA 没有批准一个单链抗体（scFv）上市， 但是有10 多个项目在临床试验。 例如： Pexelizumab, 为 Alexion Pharmaceutical 公 司研制，在2004 年进入临床I 期，正在临床III 期， 主要用于治疗冠状动脉疾病。
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功 能
单克隆抗体药物
治 疗 性 抗 体 发 展 历 程 和 事 件
1975 年，Kohler 和Milstein 发明了被称 之为“魔弹”的单克隆抗体技术，并在 1984 年获得了诺贝尔奖。 1986 年，美国FDA 批准了第一个单克隆 抗体药物Orthoclone-OKT3 上市。 1994年，美国批准了第二个抗体药物嵌合 抗体ReoPro 上市； 1997 年，由Genentech公司生产用于治疗 淋巴瘤的Rituxan 上市，成为了第一个重 磅炸弹的单克隆抗体药物； 2002 年，第一个全人源化单克隆抗体 Humira 上市，人源化技术成熟后，进入 临床试验的抗体药物增长率明显开始高于 小分子药物。
小分子化学药、多肽药物与蛋白质 药物的比较
结构 分子 稳定 生物 特异 免疫 纯度 成本 量 性 活性 性 原性
小分 子化 学药 多肽 药物 蛋白 质药 物 一般 ≤ 500 好 较低 弱 无 高 低
500- 较好 10000 一般 差 ≥ 10000
高
强
无或 很低 有
高
高
高
强
较低
更高
基因工程 重组表达
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
Fab 抗体片段
• 抗体的Fab 区域含可变区和恒定区，可以与特异 的抗原结合， Fab 抗体片段药物有更好的穿透力。 只含有 一个Fab 臂。分子量在~50KD。 • 例如：2010 年FDA 批准的肿瘤坏死因子 TNF 单 克隆抗体 Fab 片段。
• ADCs （ antibody-drug conjugates ）是新一类的 靶向性抗体药物，它是一类抗体与抗癌制剂偶联 的药物，主要用于癌症的治疗；与传统的治疗药 物相比，ADCs 在杀死肿瘤细胞的同时减少了副作 用。并且具有抗体的靶向功能。 • Genentech 公司的T-DM1 已经在2013 年2月正式 上市，T-DM1 是Herceptin 与化疗制剂偶联。有 研究表明，该药能为HER2阳性乳腺癌患者提供更 长的无进展生存期，同时，严重副作用事件仅为 赫赛汀及化疗药物未偶联情况下的一半。
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抗体—生物体最奇妙的分子
无限的多样性（diversity)
功能与结构的双重性
可变区—抗原结合 恒定区—生物学效应功能 分泌型和膜型表达
抗体
• 抗体是机体在抗原刺 激下产生的能与该抗 原特异性结合的免疫 球蛋白。
可变区
重链和轻链 N 端约 110 个氨基 酸为可变区（variable region,V区)， V 区 存 在 3 个 高 变 区 （ hypervariable region,HVR1~3) 及4个骨架区（framework region, FR1~4). 三个高变区共同组成 Ig 的 抗原识别部位，形成与抗原决定 簇互补的表位。高变区也称互补 决 定 区 （ complementaritydetermining region, CD1~3)。
多肽/蛋白质： 多个α-氨基酸通过肽键相连而形成的化合物。
由一个氨基酸的羧基（-COOH）与另一个氨基酸的氨基 （－NH2）相互连接所形成的化学键（-NH-CO-]。
通常由10~100 氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫 多肽, >100 氨基酸组成的则称为蛋白质。 也有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽； 10~50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨 基酸组成的肽就称为蛋白质。 多肽一般只有一、二级结构，不象蛋白质那样具有高 级结构。
免疫球蛋白水解片段
Fab Fab
木瓜蛋白酶 Fc
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶 胃蛋白酶
F(ab’)2
pFc’
F（ab’）2 片段
• 实验室可以通过胃蛋白酶将抗体的铰链区切断， 形成 F(ab’)2 片段；两个Fab 通过二硫键连接 形F(ab’)2。分子量在~100KD 。通过基因工 程表达的F(ab’)2 ，在保持抗原性和特异性的 同时，降低了免疫原性，F(ab’)2 还延长了半 衰期。 • 例 如 ： 2011 年 FDA 批 准 的 Centruroides (Scorpion) Immune F(ab’)2 [Anascorp] 治疗 蝎毒 的F(ab’)2 抗体片段。
人源化抗体
利用现有的大量已详细分析过的小鼠抗体，取其 与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区， CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可 维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎完全 去除免疫原性和毒副作用。 人源化抗体成功的例子：Herceptin：Genentech 公司的抗HER2/neu 抗体，用于治疗乳腺癌。是 人表皮生长因子的受体-2（Her-2）重组DNA 衍 生的人源化抗体，95% 的人源和5% 的鼠源。
类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩病、 溃疡性结肠炎，强直性脊柱炎 中度至重度斑块型银屑病、类风湿性关 节炎，银屑病关节炎 克罗恩病及活动性溃疡性结肠炎患者， 类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，银屑 病关节炎 非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病， 类风湿性关节炎 哮喘和慢性阻塞性肺病，包括慢性支气 管炎和肺气肿 糖尿病 转移性结直肠癌，非小细胞肺癌，胶质 母细胞瘤，转移性肾癌 HER2阳性的乳腺癌、转移性胃癌 高血脂高胆固醇症 精神分裂症
小分子抗体
鼠单抗人源化
双特异抗体
• BsMAb ， BsAb ，是人工的蛋白质（非天然存在 的），将两个不同抗体的片段组合在一起，可以 与两种特异的抗原结合，其中一个针对靶抗原， 另一个针对效应分子或细胞，由此增强抗肿瘤、 抗病原体的效应。
抗肿瘤抗CD3双特异抗体的作用机制
抗体-药物偶联物(ADCs)
通过基因重组改良抗体性能
•人源化抗体（降低抗原性） •小分子抗体（穿透力强） •双特异性抗体（增强抗体的亲和力及 与靶细胞的相互作用） • 抗体药物偶联物（增加蛋白的半衰期； 与药物，毒性分子或酶基因融和表达， 可用于肿瘤等疾病的治疗）
鼠源抗体
使用异种抗原免疫小鼠，然后通过纯化小鼠的 腹水得到针对该抗原鼠的多克隆抗体，再经过 骨髓瘤细胞融合得到可持续表达的单克隆抗体。 例如：1986 年FDA 批准的Ortho Biotech 公 司Orthoclone-OKT3 。 此方法生产的抗体是通过直接免疫动物生产的， 方法成熟, 产量可达1-15 g/L，单抗亲和力高， 但是生产周期长，难以大规模生产，主要的杂 质为鼠源性生物大分子和脂类等。鼠源抗体可 诱导产生人抗鼠抗体反应（HAMA），不仅影 响疗效，而且增加患者后续应用的临床风险。
重组DNA分子在细菌或哺乳 动物细胞中进行表达的过程。
来源
化学合成
对于氨基酸个数在 50 个以下 的多肽，化学合成具有显著 优势。固相法合成技术的产 生，极大推动了多肽药物的 发展。 由于多肽类物质在生物体内含 量甚微，提取时纯度也不够， 并且周期长，限制了从动植物 中提取多肽药物的临床应用。
从动植物 中提取
鼠源抗体存在的问题
不能有效激活人体中补体和 FC 受体相关的 效应系统； 被人体免疫系统所识别，产生 HAMA 效应； 在人体循环系统中很快被清除。
• 20 世纪 80 年代以来，随着分子生物学技术 的发展和抗体基因结构的阐明， DNA 重组 技术开始应用于抗体的改造，先后出现了嵌 合抗体和人源化抗体，这两类抗体可以弥补 鼠源性抗体的不足。
• 进入 20 世纪 90 年代，随着 PCR 技术、抗体库 技术和转基因技术的发展，治疗性单抗最终实
现全人源化，使抗体最终可应用于临床治疗 。
全人抗体
基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜的能力而建 立一系列的抗体文库，然后用目的抗原来筛选文 库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功 能的完全人抗体。 全人抗体成功的例子：Humira：abbott 公司（雅 培）抗TNF 全人单抗，用于治疗关节炎。
Байду номын сангаас
1984年诺贝尔生理学或医学奖
César Milstein
Georges J.F. Köhler
“ the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies”
抗体技术的发展经历了三个阶段
第一代：多克隆抗血清 第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体
蛋白质与多肽类药物 的研究及应用
昆明医科大学基础医学院 生物化学与分子生物学系 武静
目前市场上的主流药物
小分子化合物药物
优点：相对分子量小，易透过细胞膜，物化性
质明确，稳定及热不敏感，无抗原性，直接化学 合成，价格低廉，口服给药等 缺点：副作用大，易引起抗，耐药性等
生物药物 疫苗 小分子
多肽和蛋白质
人－鼠嵌合抗体
用人IgG 的恒定区取代小鼠IgG 的恒定区，保留鼠 单抗的可变区序列，形成一个人 - 鼠杂合的抗体。 其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性， 却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另 外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗 体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。 嵌 合 抗 体 成 功 的 例 子 ： Rituxan ： Idec pharmaceutical/Genentech 的小鼠抗CD20 抗体， 含人IgG1 恒定区，用于治疗B 淋巴瘤。它的抗淋巴 瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC 和诱导肿 瘤细胞凋亡。
恒定区
• 重链和轻链 C 端为恒定区，不同 Ig 重 链 其 不 同 长 度 ， 有 的 只 有 CH1~3, 有 的 则 由 CH1~4，CH2 （IgG) 或 CH3（IgM) 有补体结合 位点。 • 相同种属、同一类别的Ig 氨基酸 序列基本恒定。
铰链区
• 铰链区位于CH1和CH2之间，含 有丰富的脯氨酸。 • IgG1,IgG2,IgG4和IgA的铰链区 较短，而IgG3和IgD的 铰链区较 长；IgM和IgE无铰链区。