外源基因的表达

第六章外源基因的表达

1、名词解释

融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。

分泌蛋白：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。

包涵体：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。

外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。

2、大肠杆菌表达载体构成的重要元件有哪些？

①启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7。②核糖体结合位点。③插入位点

④终止子⑤复制起始区⑥选择标记

3. 试比较大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞基因表达载体各自组成的特点。

（1）大肠杆菌基因表达载体构成的重要元件（见上题）；

（2）酵母表达载体的重要组成原件

•复制起始区：

•选择标记：营养缺陷型；显性选择标记

•有丝分裂稳定区

•表达盒（expression cassette)：启动子、分泌信号序列和终止子。

（3）植物基因表达载体的组成特征：

•以Ti质粒为基础构建而成。

•启动子：组成型、诱导型和组织特异型。

•终止子：rbs小亚基基因3’端终止子序列。

•T-DNA：边界序列25bp正向重复序列，为控制外源基因的转移和整合必需的功能元件。•内含子序列：有效提高成熟mRNA的含量，提高外源基因的表达水平。

•选择标记与报告基因

（4）动物细胞基因表达载体组成特征：

①、启动子②、复制子③、mRNA剪接和加尾信号④、筛选标记

4. 真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题和高效表达的对策是什么？

真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题：

•真核基因的结构具有内含子，而大肠杆菌等原核生物没有转录产物剪接加工系统。

•真核生物mRNA的结构与大肠杆菌中的不同，影响到真核mRNA在原核细胞中的稳定性及与核糖体的结合能力。

•真核生物的基因对简并密码子的使用偏好与大肠杆菌的不同。

•大肠杆菌细胞没有真核生物的蛋白质加工修饰系统，使表达产物不能正常折叠。

•大肠杆菌内源蛋白酶会对真核基因表达产物产生降解，造成表达产物的不稳定性。真核基因在大肠杆菌中高效表达的对策：

•克隆真核基因的cDNA或化学合成不带内含子的基因进行表达。

•将SD序列（核糖体结合位点）引入表达载体，使之位于转录起始点的下游和插入外源基因的上游，保证SD序列与起始密码子间的准确距离和碱基组成，防止核糖体结合位点附近序列转录后形成茎环二级结构。

•通过点突变等方法将外源基因中的密码子转化为大肠杆菌等受体细胞高频出现的同义密码子。

5. 基因表达产物的检测方法有哪些？

•报告基因的酶法检测

•酶联免疫吸附法

•Western印迹法

•表达产物生物学活性检测