12、血清谷丙转氨酶活性的测定

质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单
位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位 =0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。



4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L） 称 2，4－二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐 酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 5) 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后 定容至 100mL。此溶液浓度为 2μ mol/mL，临用前 配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸缓冲液 （pH7.4）。 3、器材 试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL）， 量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光 光度计，坐标纸。
实验内容和步骤

1) 制备标准曲线
2) 绘制标准曲线

以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横 坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对 应的酶活性单位数的标准曲线。
3) 样品测定
结果计算
标准曲线测定法 根据样品管 A520 值（已减去空白管 A520） 查标准曲线，即得每 100mL 血清中转氨酶 活性单位数。 标准管测定法
King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血 清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生 成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取 血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清 计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例 如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。
（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。
验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温
度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度 下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物
血清谷丙转氨酶活性 的测定（Kቤተ መጻሕፍቲ ባይዱng法）


【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【原理】

生物机体内转氨基作用是α -氨基酸的氨基通过酶促作用转移到 α －酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。 催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸 吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾 等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase , GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水 平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变 时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从 而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著 升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要 的参考价值。
4) 转氨酶只能作用于α －L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对 D－氨基酸无催 化作用。实验室多用α －DL 氨基酸（因较 L－氨基酸价廉），如采用α ―L―氨基酸, 则需按α －DL 氨基酸的用量减半。 5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。 6) 血清转氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定， 其结果应乘以稀释倍数。 7) 每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。

注意事项
1) 为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、 试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。 2) 空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。 3) 作为标准物质的丙酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄 或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。 丙酮酸钠重结晶：取纯丙酮 8 份与蒸馏水 2 份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱 和。此时溶液上层无色，下层有棕黄色油状物。取出上层无色液体置烧杯中，加入两 倍体积的丙酮（无水）混匀后，置冰箱中数小时，则有白色丙酮酸钠析出，用布氏漏 斗收集沉淀，并用纯丙酮洗涤两次，抽干后，置干燥器内，保存、备用。
试剂与器材

1、样品 动物或人血清 2试剂 1) 甲液（1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A. R.）9.47g 或含十二水磷酸 氢二钠（Na2HPO4·12H2O，A. R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 2) 乙液（1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液） 称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A. R.）9.078g溶于蒸馏水中定容 至 1000mL。 取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此液 PH应为 7.4。 3) GPT 基质液 称取α －酮戊二酸 29.2mg（2mmol/L）及α －DL－丙氨酸 1.78g（200 mmol/L）溶于 50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液约 0.5mL，调节 pH为 7.4，然后加磷酸缓 冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。

每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液 （2μmol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表 操作，不做标准曲线，测定A520按下公式 计算：
比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法
不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此 它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在 37℃条件下与底物作用60 min，生成1μ mol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min，每 生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实

血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境 中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关 系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或 通过标准曲线查出血清中ALT的活性。