酶的固定化与修饰

固定化酶PH的变化：
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把 主体溶液称为宏观环境。
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
2）产物性质对pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游
离酶的pH值高；反之则低。
最适温度变化：
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显 的变化。
制备方法：
（1）界面沉淀法：
利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解 度极低而形成皮膜将酶包埋。 例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的有机相 中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物加入乳化液中, 然后使高聚物在油水界面沉淀析出,形成膜,将酶包埋, 最后移入水相中。 此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残留有机溶 剂很麻烦。
交联试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。
交联法的形式
交联法有2种形式： 酶直接交联法
双重固定法 （1） 吸附交联法
酶辅助蛋白交联
（2） 交联包埋法
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍 生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子 强度、温度和反应时间之间的平衡。
酶的固定化与修饰
华东理工大学生物工程学院
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 酶的修饰 第五节 固定化新技术与发展趋势 第六节 固定化酶的应用
什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized enzyme） ：固定在一定载体上， 在一定空间范围内起催化作用的酶。
氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的 -OH、-SH等反应。使酶固定化。如：
如：
CMC(羧甲基纤维素)
R-O-CH2 –COOH +CH3OH R-O-CH2 –COOCH3 +H2O R-O-CH2 –COOCH3 +NH2-NH2 R-O-CH2 –CONH2-NH2 + CH3OH
2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱 中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量。
3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续 测定，从而测定固定化酶的酶活力。
第三节 固定化酶的制备
一． 一般方法及特点 二． 酶的固定化方法
固定化酶的制备原则
✓ 必须注意维持酶的催化活性及专一性 ✓ 固定化应该有利于生产自动化、连续化 ✓ 固定化酶应该有最小的空间位阻 ✓ 酶与载体必须结合牢固 ✓ 固定化酶应有最大的稳定性 ✓ 固定化酶成本要低
一． 一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定 性研究、改进。 1． 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
优点 条件温和、操作简便、活力损失少。 缺点 酶与载体结合不牢固，使用时需严格控
制好pH值、离子强度、温度等操作条件。
2、共价键结合法
★通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。 载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝 胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚 物等。 ※载体→活化→活化载体基团＋酶分子基团
固定化后酶稳定性提高的原因： a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
PH的变化
pH对酶活性的影响： 1） 改变酶的空间构象 2）影响酶的催化基团的解离 3）影响酶的结合基团的解离 4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合 后不能生成产物。
H2N
O
O R
OH
氨基甲酸 衍生物
O
R
NH
O
亚氨碳酸 酯衍生物
NH
NH ENZ 异脲型
N ENZ亚氨碳酸酯型
O
氨基甲酸酯型
NH ENZ
（4）烷基化法
含羟基的载体可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴 等多卤代物活化。活化载体上的卤素基团可 与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基 化反应，制备固定化酶。
e.g.
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
OHC
+ (CH2)3 CHO
ENZ
N HC N ENZ
N HC
(CH 2)3 N
ENZ
N
CH
N
CH
优点 结合牢固，酶不会脱落，可长时间使用。
（2） 载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]， 则ρ>1,Km'<Km
米氏方程推导:
三． 评价固定化酶的指标：
1． 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化 一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单 位。
——计量单位
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
——品质的体现
3.
4.
或称偶联效率，活力保留百分数。
5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的 固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活 力.
固定化酶的活力测定方法介绍
1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶 液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反 应液进行酶活力测定。
R-OH+ Cl
Cl
N N
N
Cl
E-NH2
NH-E
N R-O N N
Cl
Cl
N R-O N N
Cl
硅烷化法
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
多孔玻璃特点：
①机械强度好，表面积大。 ②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命 长等。
硅烷化法
硅烷化法
（四）交联法
利用双功能试剂，在酶分子间或酶与载体间，或酶 与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的方 法。
（3）溴化氰法
对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂糖来说 是最常用的反应。在碱性条件下载体-OH和BrCN 反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯衍生物，它们在碱 性条件下可与酶的氨基进行共价偶联反应。
OH CNBr（ 碱 性 ）
R
OH
碱性
O R
+ENZ
O
NH
N
O R
水
OH
O R
OH O
R O
O R
OH
交联反应条件激烈，酶的多个基团被交联，
缺点
致使酶的活力损失大。制备的固定化酶颗 粒较小，不便于使用。
双重固定化
（五）热处理法
将含酶细胞在一定温度下热处理一段时间，使酶 固定在菌体内。
只适用于热稳定性较好的酶的固定化。
如：将培养好的含葡萄糖异构 酶的链霉菌在60~65℃温度下处 理15min，可以使葡萄糖异构酶 固定在菌体内。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
交联反应可以发生在酶分子间也可以发生在酶分子内。 在低酶浓度下一般形成分子内交联，交联后的酶通常保 持溶解状态。在酶浓度升高情况下分子间交联比例上升。 形成的固定化酶通常为不溶解状态。 酶50-200mg/ml，戊二醛0.3-0.6%时，固定化酶活性高。 一般主张交联剂和酶最适合比例为1：10（W/W）。采 用的pH值一般与被交联的酶的等电点相同。
（2）界面聚合法：
利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原理 包埋酶。
例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶液 混合，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和有 机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。
（三）结合法
1、离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、 DEAE-葡 聚糖凝胶、CM-纤维素。
R-O-CH2 –CONH2-NH2 +HNO2 R-O-CH2 –CON3 +H2O
R-O-CH2 –CON3 +E-NH2 R-O-CH2 –CON3 +E-OH R-O-CH2 –CON3 +E-SH
R-O-CH2 –CONH-E R-O-CH2 –CO-O-E R-O-CH2 –CO-S-E
（二）包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中， 使酶固定化的方法称为包埋法。
根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分为：凝 胶包埋法和半透膜包埋法两类。
1、凝胶包埋法
❖将酶分子包埋在凝胶格子里。
❖凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产物分子很 大的酶类的固定化。
条件温和，操作简便，对酶活 影响小，但强度差。
天然凝胶： 琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、
包埋材料
角叉菜胶、明胶等；
合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等
强度高，对温度、pH值变化耐受性强， 需要特定的聚合条件，酶易变性。
2、半透膜包埋法（微囊化法）
将酶包埋在有各种高分 子聚合物制成的小囊中， 制成固定化酶。
半透膜：聚酰胺膜、火 棉胶膜等。
适用于底物和产物都是 小分子的酶的固定化。
底物特异性变化：
作用于低分子底物的酶 有明显变化。
特异性没
既可作用于低分子底物又可作用于大分
子底物的酶
特异性往往会变化。
米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化：
由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km'=Km/ρ(表观米氏常数)
（1） 载体与底物带相同电荷，[Si]<[S], ρ<1, Km’>Km 固定化酶降低了酶的亲和力。
复分批反应和装柱连续反应； ➢ 酶反应过程能够加以控制； ➢ 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ➢ 较游离酶更适合多酶反应； ➢ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ➢ 酶的使用效率提高，成本降低。
缺点
• 固定化时，酶活力有损失； • 工厂初始投资大； • 只能用于可溶性底物； • 胞内酶必须经过酶的分离。
（1）重氮法
适用于含有苯氨基的不溶性载体 载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后再 在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或咪唑 基进行偶联。
Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷 酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化百度文库体连接。
（2）叠氮法
含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠
各类固定化方法的特点比较:
2． 选择方法依据： （1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
3． 固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （ 3） 考察固定化酶最适反应条件
二． 酶的固定化方法
（一） 吸附法 （二）包埋法（entrapping method） （三）结合法 （四）交联法
酶和细胞固定化示意图
（一）吸附法
定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在
其表面上而使酶固定的方法称为物理吸附法，简称吸 附法。
常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶 瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 ▪优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉 价、可反复使用。 ▪缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。
3. 固定化方法的影响
二、固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。 2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 （3 ） 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 （4）对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高
酶辅助蛋白交联
为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引 起酶失活，可使用第二个“载体”蛋白质。
（1） 吸附交联法
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大 孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此 法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
（2）交联包埋法
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体， 然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗 粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
为什么要对酶进行固定化？
对酶而言： 1、稳定性差 2、回收困难，一次使用 3、产物的分离纯化困难
核心：成本问题！
固定化酶的优缺点
优点
➢ 固定化酶可以重复，使用效率高，成本低 ➢ 极易将固定化酶与底物、产物分开； ➢ 在大多数情况下，能提高酶的稳定性； ➢ 具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反
第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一． 影响固定化酶性质的因素 二． 固定化后酶性质的变化 三． 评价固定化酶的指标
一． 影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸 残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
2． 载体的影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应