米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究

米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究

米曲霉蛋白酶的耐盐性与酱油蛋白质利用率和氨基酸含量密切相关,目前对米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）蛋白酶的耐盐性及其耐盐机理研究较少且不够深入。因此,选育高产蛋白酶米曲霉并研究其所产蛋白酶的耐盐机制具有重要意义。

本文以米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）为原始菌株,利用常压室温等离子体诱变（ARTP）技术得到一株高产蛋白酶诱变菌株,从诱变菌株中分离、纯化和鉴定出两种耐盐蛋白酶—天冬氨酰氨肽酶（AAP）与碱性蛋白酶（AP）,并在分子水平上初步阐明了两种蛋白酶的耐盐机制。（1）利用ARTP技术选育出一株高产蛋白酶米曲霉诱变菌株H8。

采用ARTP诱变技术选育到一株高产蛋白酶、遗传稳定（传代15次）、孢子颜色发生变化的诱变菌株H8,其中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和天冬氨酰氨肽酶酶活比原始菌株分别提高了31.82%、19.36%、20.76%和24.77%。诱变菌株H8生物量比原始菌株提高2.9%。

应用RT-qPCR方法进一步证实,高产蛋白酶菌株H8中AAP和AP基因转录水平分别高于原始菌株米曲霉27%和30%,说明AAP基因与AP基因转录水平提高是引起种曲发酵酶活提高的因素之一。ARTP处理可能加强了米曲霉AAP和AP基因的转录表达,进而提高了两种酶的酶活。

（2）从诱变菌株H8中分离纯化出耐盐天冬氨酰氨肽酶（AAP）并阐明了其初步耐盐分子机制。利用磷酸盐缓冲液提取、现代色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等技术从诱变菌株H8中分离纯化和鉴定出耐盐蛋白酶—AAP。

结合理化特性分析可知该酶分子量约57 kDa含有Zn²⁺,其最佳和最稳定的pH值和温度分别为7和50°C。蛋白质同源建模、分子动力学模拟、二级结构、酸性残基和内部残基疏水性分析表明,与对照蛋白酶相比,该酶在高盐环境下有序二级结构含量较高、水合表面酸性残基与特定碱性残基之间形成的盐桥较多、内部残基疏水性较强,这是该酶可能的耐盐机制。

（3）从诱变菌株H8中分离纯化出耐盐碱性蛋白酶（AP）并阐明了其初步耐盐分子机制。利用磷酸盐缓冲液提取、现代色谱和MALDI-TOF-MS等技术从诱变菌株H8中分离纯化和鉴定出耐盐蛋白酶—AP。

结合理化特性分析可知,该酶分子量约29 kDa、是一种不依赖金属离子的丝氨酸蛋白酶,其最佳和最稳定的pH值和温度分别为9和40°C。蛋白质同源建模、分子动力学模拟及蛋白质二级结构、酸性残基和内部残基疏水性分析表明,与对照相比,该酶在高盐环境下有序二级结构含量较高、水合表面酸性残基与特定碱性残基之间形成的盐桥较多、内部残基疏水性较强,这是该酶可能的耐盐机制。

本研究结果将对酱油发酵工艺优化和调控及新菌种选育提供方法参考和依据。