铜绿假单胞菌最佳电转化条件的研究

难以将其导入
到 ! ! "#$%&’()*" 中， 而 ! ! "#$%&’()*" 的电转化条件 ［* + ,］ 报道很少 ， 且主要研究的是不同生长条件、 不同 电压对转化效率的影响， 难以满足将 #$ 转座复合 物导入到 ! ! "#$%&’()*" 细胞中的要求。本实验详细 地研究了不同细胞生长状态、 不同电击电压、 不同细 胞浓度、 感受态细胞的不同贮备方式对转化效率的 影响， 筛选其最佳电转化条件、 提高转化效率， 为实 现将 #$ 转座复合物导入到 ! ! "#$%&’()*" 细胞中， 并通过耐药表型的改变研究其耐药的分子机理奠定 基础。
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遗传学报
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铜绿假单胞菌 （ ! ! "#$%&’()*" ） 是一种重要的条 件致病菌， 由于其具有多重耐药特性， 因而常在临床 上引起反复性、 顽固性感染， 成为临床治疗的一大棘 手问题 。但其耐药的机理仍有许多未知的空间等 待探索， 因此弄清耐药的分子机制， 对于解决由 ! ! 有极其重要的意义。 "#$%&’()*" 引起的难治性感染， #$ 转座重组技术是最近两年发展起来的以 #$ 噬菌体为基础， 人工组建的转座重组系统。它具有 随机单点插入到基因组中的优点， 并通过插入位点 基因的失活引起细菌表型的改变 。这就为人们从 反向遗传学角度研究细菌的基因组功能提供了先进 的手段。目前， #$ 转座重组技术已被应用到病毒、 大肠杆菌等病原微生物的功能基因组研究中。但用 该方法研究 ! ! "#$%&’()*" 的基因组功能， 国内外均 未见报道。由于 #$ 转座复合物分子量大、 转化率 低， 用传统的转化方法如 #&’(% 法
收稿日期： 修回日期： &’’) 2 ’( 2 **； &’’) 2 *’ 2 *) 基金项目： 国家自然科学基金 （编号： ［.4556#789 :; /"7<6="> /"74#"> .$<8=$8 ?64=9"7<6=（ /6@ )’&0’’03） ］ )’&0’’03） 作者简介： 单志英 （*1,) 2 ） ， 女， 在读博士， 研究方向： 分子遗传学。 ABC"<>： D%<;<=EF%"=G *,) @ $6C ! 通讯作者。 ABC"<>： C<=EH<"=EH<"6G ;"%66@ $6C@ $=
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"!"!* 试 剂 卡那霉素标准品购自北京生物制品检定所； 胰 蛋白胨为 KHLM@ 公司产品； 酵母抽提物为 ?N@HO 公司 产品； 分子量标准 K=": 777， K=% 777 为大连宝生物 公司产品； 其他试剂均为国产分析纯。 "!"!: 仪 器 #HMP@ >$(QAP 电转化仪为 RH@5SFO 公司产品； T15 2.’T1 %7-S5:%K 高速冷冻离心机为日立公司产品； KU5V" 电泳仪为北京生化仪器厂产品； W:% 分光光 度计为上海分析仪器厂产品。 !"# 方 法
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Available from: Mingqiang Qiao Retrieved on: 04 July 2015
遗传学报
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" ! % ! " 质粒的提取及定量 ［W］ 大量提取 从荧光假单胞菌中， 按碱裂解方法 质粒 >6#’%/， 以 K=": 777 做 KY. 79/X 琼脂糖电泳， 含量标准， 用 1<F&A #FQJAP 系统对质粒进行定量。 " ! % ! % 感受态细胞的制备 参照文献 ［ *］ 并加以改进。将过夜增菌的铜绿 假单胞菌 -.,/ 按 " Z "77 接种于数个 :7 <= =5EP@JI 培养基中， 使用 W:% 分光 )W[ ， %77 P;<H\ 振荡培养， 光度计测定细菌培养物在 :*7 \< 处的吸光度， 分别 在 ,-:*7 介于 79) + "97 之间的不同生长时期终止培 养， 使用 S-S",5*"C 转子在 %[ 条件下， W 777 P ] <H\ 离心 "7 <H\， 收集菌体。依次用等体积、 ";% 体积、 洗涤 ";:体积冰浴的 )77 <<@(;= 蔗糖溶液重新悬浮、 菌体， %[ ， W777 P ] <H\ 离心 "7 <H\。最后根据菌体的 多少加入不同体积的 )77 <<@(;= 蔗糖溶液将菌体混 匀， 活细胞计数确定细胞浓度。将感受态细胞分装 成 "77 ! 一部分直接用于电转化， 另一部分在 =; 管， 液态氮中冷冻后， 放 ^ /7[ 冰箱中保存， 其余部分直 接放 ^ /7[ 冰箱保存备用。 " ! % ! ) 电转化 取感受态细胞 "77 ! 质粒约 :7 \&， 加入预冷 =、 的 79% M< 电转化杯中， （ 阴性对照只加感受态细胞 不加质粒） 在 RH@5SFO 电穿孔仪上， 设置电容 %: ! _， 电阻 %77 #， 用不同的电压进行电击， 然后将转化体 系加入 )W[ 温浴的 C77 ! = =5EP@JI 培养基中。)W[ ， 培养 " I 。将菌液用 =5EP@JI 培养基按不 %%: P ] <H\， （含 同的比例稀释后取 "77 ! = 涂布在筛选培基上 ） ， 培养 。阴性对照除不 4< :7 ! &;<= )W[ ", I + "/ I 加质粒外， 其余过程与其他样品完全相同。在筛选 培基上阴性对照没有菌落生长的情况下， 统计转化 子数， 计算转化效率。
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[The study of optimal conditions of electroporation in Pseudomonas aeruginosa].
铜绿假单胞菌最佳电转化条件的研究
单志英，徐海津，施兴启，聂 舟，遇 言，张秀明，白艳玲，乔明强! ，高才昌
（南开大学分子生物学研究所，天津 )’’’0*）
摘
要：以临床分离的一株铜绿假单胞菌 （ :0&;?+@+’$0 $&5;-(’+0$ ） 将具有卡那霉素抗性标记的质 VJ,W 作受体菌，
粒 5.!U&W 通过电转化导入到受体菌中， 研究细胞生长状态、 电击电压、 细胞浓度、 感受态细胞的贮备方式对转化效 率的影响。结果表明， 在细胞生长至 <=3(’ ‘ ’\0 + ’\W 时收集菌体， 在低温 （&e ） 条件下， 制备浓度为 *’** 个细胞 ^CS 的感受态细胞， 在较高的电压 （ &\, Zb） 电击下， 能获得较高的转化效率。最高可达 *\,W ] *’W 个转化子 ^" E _/J （U?N^" 。用此优化的转化条件， 在国际上首次成功地将 !4 转座复合物导入到 : @ $&5;-(’+0$ 中， 并获得 &\( E _/J） 克服了传统转座子能在染色 ] *’( U?N^" E _/J 的高转化效率。由于 !4 转座重组技术具有随机单点插入的优点， 体上迁移的缺点， 保证了表型的改变与转座子插入位点所在的基因突变的一一对应关系， 为进一步研究 : @ $&5;-(> ’+0$ 的基因组功能奠定基础。 关键词：铜绿假单胞菌；电转化；!4 转座复合物 中图分类号：P1) 文献标识码：J 文章编号：’)01B(*0& （&’’(） ’)B’)**B’,
ARTICLE in ACTA GENETICA SINICA · APRIL 2004
Source: PubMed
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