荧光定量PCR技术-适用版

Melt curve: 导数图谱
Fluorescence
一个干净的峰 = 没有无关的产物
Temperature
Melt curve的杂峰
可能是引物二聚体
多余的峰是如何产生的?
非特异扩增
1、转录组中错误的目的基因。 2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测 cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值)。
然而，如果探针断裂了……
光能
TaqMan® 化学原理
Denaturation变性 (95ºC)
TaqMan® 化学原理
Annealing退火 (60ºC)
Taq酶登场……
TaqMan® 化学原理
找到引物序列……
TaqMan® 化学原理
开始பைடு நூலகம்伸 (60ºC)
TaqMan® 化学原理
Extension延伸 (60ºC)
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
T A
G C
A G
T
G GA C
TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT
Mg2+ Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+ Mg2+
定量PCR是如何工作的?
• 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行: > 双链DNA模板变性
> 引物与模板退火 > 引物延伸������ 新的扩增片段
理论上每经过一个 循环目的基因的数 量都会增加一倍
定量PCR是如何工作的?
• 在PCR混合液中含有荧光物质。
定量PCR是如何工作的?
无论哪个型号，所有的荧光定量 PCR仪都有三个共同 的组成部分
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 化学原理
解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结合点
引物二聚体
TaqMan®, 还是 SYBR® Green?
...
到底用哪一种化学方法呢？
TaqMan®, 还是 . . . SYBR® Green I?
• 优点 – 更高的特异性 – 不会有引物二聚体干扰 – 支持多重荧光实验设计 – 实验方法易于优化
TaqMan® 化学原理
第三段短片段序列，又称为探针, 位于序列中间
TaqMan® 化学原理
探针标记两种 染料分子
报告染料 Reporter dye
淬灭染料 Quencher dye
TaqMan® 化学原理
光 (激发)
完整的探针
Reporter没有
荧光信号
能量
（发射）
TaqMan® 化学原理
为什么要用定量PCR？
一个好的定量PCR数据 重复性好 灵敏度高 动力学范围宽
PCR的动力学曲线和四个阶段
1: 重复性好
2: 灵敏度高
可以检测到低拷贝的目的基因
3: 动态范围宽
兼具重复性和准确性的起始模版浓度范围 (越大越好)
重复性 准确性 动态范围
3个阶段中 最佳时期
指数扩增期
• 只有一个扩增期提供高质量的数据
指数扩增期
为什么要用定量PCR？
快：节省时间和劳力（不用电泳检测）。
为什么要用定量PCR？
安全：不用EB或放射性物质
定量PCR的化学原理
支持的化学试剂
TaqMan®
SYBR® Green I
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 中会使用到两段短片段序列，称为双向 特异引物
SYBR® Green I 染料
SYBR® Green I 染料
SYBR® Green I 染料的缺点
非特异结合任意 双链DNA
非特异性PCR产物信号
定量结果不准确
使用 熔解曲线Melt curve (Dissociation Curve) 检查反应特异性
Fluorescence
Temperature
• 缺点 – 价格稍贵
• 优点 – 价格便宜 – 大部分基因以及少量样 品均适用
• 缺点 – 特异性稍差 – 必须要做 Melt curves – 不支持多重荧光设计 – 实验方法通常需要优化
定量PCR的数学原理
怎样获得结果
荧光定量PCR技术
汪瑾 生命科学实验中心
2019.09.26
定量PCR是如何工作的
荧光定量PCR是什么
一种实时监控目的基因PCR 扩增的技术
定量PCR是如何工作的?
传统PCR
具有以下基本要素dsDNA模版, primers引物, dNTPs核苷酸 , PCR buffer缓冲液, Taq polymeraseDNA聚合酶等
定量PCR是如何工作的?
● 随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增 加而增加
PCR
PCR product
Lots of PCR
PCR
定量PCR是如何工作的?
Real-time PCR仪会记录每个循环经过每个 滤光片的荧光信号变化
Cycle 1 Filter A Sample 1 Level:
TaqMan® 化学原理
Extension延伸 (60ºC)
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 化学原理
Extension延伸 (60ºC)
?
TaqMan® 化学原理
Taq酶很特别……
• 具有核酸外切酶活性， 可以‘吃掉’结合到模
板上 的DNA片段
Taq酶降解探针
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 化学原理
TaqMan® 化学原理
嗝!
TaqMan® 化学原理
每个循环后. . .
理论上，反应管中目的基因的数量增加一倍； 报告荧光的信号按照相应的比例增加； 荧光信号的增加可以在扩增曲线图上看到。
SYBR® Green I 化学原理
SYBR® Green I 染料