放射免疫法和ELISA之间的差别.

2020/3/3
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免疫放射分析法
（immunoradiometric assay,IRMA） Ag
+ *Ab
B%
Ag-*Ab + *Ab
（B）（F）
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IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA
IRMA
竞争性抗原抗体结合反应 非竞争性抗原抗体结合反应
采用标记抗原
采用标记抗体
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ELISA过程包括：抗原（抗体）吸附在固相 载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加 相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－ －待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物， 再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光 光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测 抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
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Ag + *Ag + Ab
+
+
*AgAb + AgAb + *Ag
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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B1% B2% B3% B4% B5% B6%
Ab
分离B、F
*Ag B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F
Ag 1 2 3 4 5 6
2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性 125I—大分子、3H or 125I—小分子
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二、基本方法
（二） B和F的分离
1、第一类 双抗体沉淀法
Ag
Ab(2)
+
Ab(1)
可溶性复合物
可沉淀复合物
PEG沉淀法
2、第二类 固相第二抗体法
Ab(2)
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Ab(1) Ag
非竞争性RIA，又称免疫放射分析（IRMA)
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竞争性RIA
主要特点：标记的是抗原。其原理：未知 抗原Ag+标记抗原Ag＊+已知定量抗体Ab标 记抗原与抗体复合物Ag＊Ab+未知抗原与抗 体复合物AgAb+游离标记抗原Ag＊（去除）。
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基本原理
ELISA即酶联免疫吸附测定。
其基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面
，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸 附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合 物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加 入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而 且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成 正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结 果。
浓度 25 50 100 200 40 800
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B%
标准曲线
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B% F% B/F
2.0
60
1.0
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Calibration Curve
在体外条件下, Ag与定量的*Ag对 限量的特异性Ab的竞争结合反应。
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二、基本方法
（一）基本试剂
放射免疫法和ELISA之间的差别
付涛（2012881007）
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放射免疫法
一、原理： 利用放射性同位素标记抗原或抗体，然
后与被测的抗体或抗原结合，形成抗原抗体 复合物的原理来进行分析的。
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分析方法
放射免疫法分析有两种方法：
竞争性RIA,又称传统RIA
1、抗体 2、标记抗原
3、非标记抗原 （标准品）
高纯度 化学结构、免疫活性 与被测抗原相同
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高亲和力
1、抗体 高特异性
高滴度
1）亲合常数K （affinity constant K） 反应抗体与抗原的结合能力
B/F
1.0
·斜率= -K
0.5
·
··
·
1
2
3
复合物浓度
Scatchard作
*Ag与Ag的免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
*Ag
+ Ab
+ Ag
*Ag-Ab + *Ag
(B)
(F)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
复合物 游离物
Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)
Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
试管
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三、质量控制（quality control）
1、精密度（precision） 变异系数（ CV ）
4、特异性（specificity） 交叉反应率
2、准确度（accuracy） 回收率=测定值/真实值×100% 90%~110%
A
B
5、可靠性（validity） 平行性试验
C
3、灵敏度 （sensitivity） 6、稳定性（stability）
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ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
1、将抗原吸附在载体表面；
2、加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
3、加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体

1、将抗原吸附于固相载体表面；

2、 加抗体, 形成抗原-抗体复合物；

三种主要反应试剂
二种主要反应试剂
所用抗体是限量的
所用抗体是过量的
*AgAb的量与待测Ag的量 Ag*Ab的量与待测Ag的量
呈负相关
呈正相关
反应到达平衡慢
反应到达平衡快
非特异结合主要影响高剂量区 非特异结合主要影响低剂量区
低剂量区有不确定因素
低剂量区无不确定因素
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ELISA
图
2）交叉反应率 反应抗体的specificity
工作滴度
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10 10 1000 10000100000
0
Ab稀释度
3）滴度 (titer) 抗体的稀释倍数
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2、标记抗原
1）比活度和放化纯度足够高
比活度——每微克抗原 上标记放射性核素的千 贝可数（KBq/μg）
放化纯度——具有免疫 活性的标记抗原占总放 射性的百分数。 >90%
方法的最小可测量
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B0%，NSB，ED25，ED50， ED 浙江万里学7院5
RIA 小 结
灵敏度高 特异性好 精确的定量 方法操作简便
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非竞争性RIA（MISA)
主要特点：标记的是抗体。按反应原理 又分两种：单位点IRMA,其原理：抗原只有 一个抗原决定簇，所测的抗原为小分子抗原 。双位点IRMA：抗原有两个抗原决定簇， 所使用的两种亚型抗体在与同一抗原分子结 合时互不干扰。