紫外可见分光光度计基本知识

2.入射光波长的选择
通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸 收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的 峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦 的次强峰或肩峰进行测定。
3.狭缝宽度的选择 为了选择合适的狭缝宽度，应以减少 狭缝宽度时试样的吸光度不再增加 吸光度不再增加为准。 吸光度不再增加 一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰 半宽度的十分之一。
2. 溶剂 注意如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶 液具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值
朗伯朗伯-比尔定律 一、吸光度和透光度 设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透 射光强度为 It，反射光强度为Ir，则 I0= Ia+ It+ Ir 由于反射光强度很弱，其影响很小，上式 可简化为： I0= Ia+ It
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相 同的条件下，测定各自的吸光度，建立 朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度 与含量。 As=Kcs Ax=Kcx
cs Ax cx = As
紫外紫外-可见吸收光谱的应用
紫外紫外-可见吸收光谱除主要可用于 物质的定量分析 物质的定量分析外，还可以用于物质 定量分析外，还可以用于物质 的定性分析、纯度鉴定、结构分析。
三、参比溶液的选择
测定试样溶液的吸光度，需先用 参比溶液调节透光度（吸光度为0）为 100%，以消除其它成分及吸光池和溶 消除其它成分及吸光池和溶 剂等对光的反射和吸收带来的测定误 差。
参比溶液的选择视分析体系而定，具体有： 1．溶剂参比 试样简单、共存其它成分 溶剂参比 对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸 消除溶剂与吸 收池等因素； 收池
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将 光信号转变为电信号。现今使用的分光 光度计大多采用光电管或光电倍增管作 为检测器。 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数 字显示装置等。 5
二、紫外-可见分光光度计的类型 按其光学系统可分为单波长分光光 度计和双波长分光光度计。
影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的 关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH 关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH 形状、 等）不同，吸收光谱的形状 吸收峰的位 等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位 置、吸收强度 置、吸收强度等都可能发生变化。 吸收强度等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱 1.温度 的影响不大。
二、显色反应条件的选择
对多种物质进行测定，常利用显色反 应将被测组分转变为在一定波长范围有吸 收的物质。常见的显色反应有配位反应、 氧化还原反应等。
这些显色反应，必须满足以下条件： 1．反应的生成物必须在紫外 可见光区 较 紫外-可见光区 紫外 可见光区有较 吸光能力，即摩尔吸光系数较大； 强的吸光能力 吸光能力 2．反应有较高的选择性 较高的选择性，即被测组分生成 较高的选择性 的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光 谱有明显的差别； 3. 反应生成的产物有足够的稳定性 足够的稳定性，以保 足够的稳定性 证测量过程中溶液的吸光度不变； 4.反应生成物的组成恒定。
3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合 物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定 化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一 定价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说 明该物质无共轭结构和芳香结构。
应用范围
可对物质进行定性，定量分析。 广泛的应用在冶金地质，机械制造， 环境保护，生物化学，医学卫生，临 床检验，食品卫生，药品检验，农业 化学等领域的生产。
紫外紫外-可见吸收光谱
1. 物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收是选择性 光 选择性的，利用 选择性 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性，这就是光谱法的基础 光谱法的基础。 光谱法的基础
通过测定被测物质对不同波长的光的吸 收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范 围的吸收曲线 吸收曲线。 吸收曲线 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长 λmax进行物质含量的测定。
三、吸光系数
当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光 吸光 系数，用 a表示。 系数 A= a cl a的单位为L/(g.cm)
摩尔吸光系数
当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为 摩尔吸光系数，用 ε表示。 摩尔吸光系数 ε的单位为 的单位为L/mol.cm，它表示物质的 的单位为 ， 浓度为1mol/L，液层厚度为 浓度为 ，液层厚度为1cm时，溶 时 液的吸光度。 液的吸光度
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=lgI0/It 透光度： 透光度：透光度为透过光的强度It与入射光 强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0
二、朗伯-比尔定律 朗伯朗伯朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含 有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与 吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= κ cl 式中比例常数κ 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射 光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓 度， l为透光液层厚度。
1.单波长单光束分光光度计
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特点： 使用时来回拉 动吸收池 →移动误差 对光源要求高 比色池配对
2.单波长双光束分光光度计
特点： 不用拉动吸 收池， 收池，可以 减小移动误 差 对光源要求 不高 可以自动扫 描吸收光谱
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3.双波长分光光度计
特点： 利用吸光度差 值定量 消除干扰和吸 收池不匹配引 起的误差
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１.分析条件的选择 一、 仪器测量条件的选择 1.适宜的吸光度范围 1.适宜的吸光度范围 由朗伯由朗伯-比尔定律可知： A=lg1/T=εcl 微分后得： dlgT=0.4343dT/T= -εldc 或 0.4343∆T/T= -εl∆c
代入朗伯-比尔定律有： ∆c/c=0.4343∆T/TlgT 最小，求导取 要使测定的相对误差∆c/c最小 最小 极小得出： lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。 时 吸光度测量误差最小 最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。
1.定性分析 1.定性分析 先用标准样品扫描谱图，在扫待测样品 的谱图。拿两者进行比较，可进行定性。但 此方法误差 比较大。
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方 便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260或A230/A260的比值，鉴定其纯度。
蛋白质浓度 ＝ 1552×A280－757.3×A260 × － × DNA浓度 ＝ 62.9×A260－36.0×A280 浓度 × － × 蛋白质浓度 ＝ 183.0×A230－75.8×A260 × － × DNA浓度 ＝ 49.1×A260－3.48×A230 浓度 × － × (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml)
测定方法
一、 单组分定量方法 单组分是指样品溶液中含有一种组 分，或者是在混合物溶液中待测组分的 吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。 其定量方法包括校准曲线法 校准曲线法、标准对 校准曲线法 比法和吸收系数法。
1 校准曲线法 方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选 用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列 标准溶液的吸光度，作A-c曲线 曲线，即标准曲 曲线 线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方 回归方 程。 在相同条件下测定未知试样的吸光度， 从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试 样的浓度。
紫外紫外-可见分光光度计 一、主要部件的性能与作用 基本结构: 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→ 光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统
1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
紫外可见分光光度计 基本知识
北京普析通用仪器有限责任公司
Beijing Purkinje General Instrument Co.,Ltd.
紫外紫外-可见分光光度法 紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) 它是利用物质的分子或离子对某一波 长范围的光的吸收作用，对物质进行定性 定性 分析、定量分析 结构分析, 定量分析及结源自文库分析 分析 定量分析 结构分析 所依据的光 谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的 光而产生的吸收光谱。 按所吸收光的波长区域不同，分为紫 外分光光度法和可见分光光度法，合称为 紫外-可见分光光度法。
2 单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭 缝、色散元件和准直镜等部分。 单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 棱镜 和光栅。 和光栅
3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在 0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。
2．试样参比 如果试样基体溶液在测 试样参比 定波长有吸收，而显色剂不与试样基体 显色时，可按与显色反应相同的条件处 理试样，只是不加入显色剂。
3．试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 试剂参比 测定波长有吸收，按显色反应相同的条 件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂 作为参比溶液。 4. 平行操作参比 用不含被测组分的试 样，在相同的条件下与被测试样同时进 行处理，由此得到平行操作参比溶液。
紫外-可见分光光度法的特点： 紫外-可见分光光度法的特点： 1 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和 仪器设备和 操作都比较简单，费用少，分析速度快; 操作都比较简单，费用少，分析速度快 2 灵敏度高 灵敏度高; 3 选择性好 选择性好; 4 精密度和准确度较高 精密度和准确度较高; 5 用途广泛 用途广泛。
比吸光系数 比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm 1% 时的吸光度值，用 E1cm 表示。
ε = 0.1M r E
1% 1cm
四、偏离朗伯-比耳定律的因素 （1）入射光为非单色光 ） （2）溶液的不均性。 ）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体， 蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发 射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。 （3）光程的不一致性。 ）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。