去内毒素的方法及检查方法

去内毒素的方法及检查方法

注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。

热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。

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一、热原的性质及除去热原的方法

1．高温法

热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。

2．吸附法

热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。

3．超滤法

热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除

去。

4．蒸馏法

热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。

5．酸碱法

热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。

6．其它

包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。

二、热原的检查方法

《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。

1．热原检查法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。

《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用

于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。

2．细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001

μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法

内毒素在体外的减毒在体外有多种理化和生物学方法可以使内毒素的毒性减低，这些方法可用来研究内毒素毒性的化学结构基础，或用于消除某些制剂的致热原（即内毒素）污染，或用以制备防治用的免疫制剂等。

（1）物理方法：紫外线、射线、超声波等可使内毒素毒性降低。Fust 等（1977）报导，内毒素经γ射线照射后，其对小白鼠致死性、狗体内降压作用以及抗补体等活性降低，且其程度与射线照射剂量成正比。经照射的脂多糖激活补体经典途径的能力减低，如经验0megarads 照射的脂多糖，激活补体几乎全通过替代途径。如前所述，经典途径由类脂A激发，可见照射主要作用于类脂A。Nerdar等（1977）指出经照射类脂A中的β羟经肉豆蔻酸即消失，且认为照射可使内毒素变为类毒素。Szilsgyi(1978)通过家兔实验比较，提出大肠杆菌内毒素经60Co电离照射后，引致白细胞和血小板减少及局部Shwartzman 反应的能力均明显减低，而对纤维蛋白原和补体的影响较小。

（2）化学方法：用化学药品使内毒素减毒。所用化学药品种类繁多，其机制有酸或硷的水解作用、酰化作用、脱酰化作用，转酯化作用、羟胺解作用以及氢化铝锂（LiAIH4）的还原作用等，上述作用主要影响内毒素类脂A的脂肪酸部分，如L iAIH4，使酯键断裂，经NaOH处理，使内毒素脂肪酸皂化，发生分子的化学构型改变而减毒。若再加入95%乙醇或80%二甲基亚砜可加速其皂化，故用0.03N NaOH的95%乙醇处理葡聚糖凝胶，以去除污染的致热原，效果很好。

（3）生物学方法：业已证实多粘菌素B具有使内毒素减毒的功能。多粘菌素B的阳离子氨基与内毒素类脂A的带负电荷的磷酸根结合，使内毒素失却多种生物学活性（包括致死性、致热性、抗补体的经典途径、促分裂活性、激发单核细胞产生组织因子、对白细胞、血小板

和巨噬细胞的激发作用以及对鲎珠溶解物的凝固能力等等）。因此认为多粘菌素B为类脂A的抑制剂。Craig等（1974）在实验狗体内证实多粘菌素B有抗脂多糖的活性，然而必须使用高毒性剂量，以致临术应用极为困难。Corrigan等（1979）以出血败血性巴斯德菌造成家兔的内毒素血症的前或后给予多粘菌素B，均可减低血液中内毒素量，从而提高实验动物的存活率。由于抗菌素中和毒素的作用与其抗菌作用互不相关，且该菌对多粘菌素B的抗菌作用不敏感，故实验动物经用多粘菌素B处理后，血培养仍为阳性。人体革兰氏阴性菌感染的临床症状主要由内毒素血症所引起，因此着重研究体内内毒素的中和作用具有实用意义。

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