利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量

利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量
摘要】目的建立HPLC法测定常见中药中柚皮苷的方法，测定常见中药中柚皮苷含量。

方法 Waters Symmetry C18柱（4.6x150mm,3.5μm），流动相为甲醇:乙腈:磷酸缓冲液（0.01mol/L pH3.5）=9:3:8，检测波长为280nm。

结果柚皮苷的出峰时间为2min，柚皮苷1.80～350mg/L范围内具有良好的线性关系，R2值为
0.9999，平均回收率分别为99.5%-102.5%，相对标准偏差小于5%；香橼、枳实和橘红的柚皮苷含量分别为2.89-5.67%、0.21-0.26%、11.97-2.44%，不同产地的香橼、枳实、橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差分别为28.88%、10.63%和26.42%;四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷的含量分别为5.99mg/g、2.25mg/g、1.71mg/g、0.30mg/g，不同厂家生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差分别为8.43%、14.72%、9.90%和
3.42%。

结论建立了一种简便、准确、适用性广泛地测定中药中柚皮苷的方法，产地对香橼及橘红中柚皮苷含量的影响较大，而不同厂家生产的中成药中柚皮苷的含量偏差相对较小。

【关键词】高效液相色谱法柚皮苷中药原料中成药
Determination of naringin in Chinese medicine byhigh-performance Liquid Chromatographic Method
(XUE Bai-yun, DUAN Ci-qun)
(People'shospital of Yingtan City, Jiangxi Province, Yingtan, 335000)
【Abstract】Aim: To set up a quantitativehigh-performance liquid chromatographic method for determination of naringin and to investigation naringin content in common Chinese medicine. Method: An RP-HPCL method was set up, using Symmetry C18 column, methyl alcohol: acetonitrile:PBS(containing 0.01mol/L postassium dihydrogan phospate pH=3.5)= 18:3:14 as mobile phase with a flow rate of 1.0ml/min at the detection wavelength of 210nm. Result: retain time was about 2min, naringin well separated with other compositions. The Calibration curve was ofgood linearity in the range of 1.80～350 mg/L with R2 0.999, recoveries were range from 99.5%-102.5%, relative standard derivation was less than 5%. Naringin content in Citron, Citrus aurantium, and orange-red were 2.89-5.67%, 0.21-0.26%, and 11.97-2 .44%, respectively. Relative standard derivation of naringin contents from different origin were 28.88 for citron, 10.63 for citrus aurantium, 26.42 for orange-red. Naringin content in 4 soup, stomach pain pill, orange pill bone particles and anti-proliferative Pill were 5.99 mg /g, 2.25mg /g, 1.71mg /g, and 0.30mg /g repectively. Relative standard derivation of naringin contents from different factory were 8.43 for 4 soup, 14.72 for stomach pain pill, 9.90 for orange pill bone and 3.42 for anti-proliferative pill. Conclusion: This method is accurate, sensitive and convenient for detecting naringin content of Chinese medicine, Origingreatly effects naringin content of the citron and orange-red ,whereas, naringin content of Chinese patent medicine are little affected by origin.
【Key words】High-performance Liquid Chromatographic Method, naringin, Chinese medicine, raw material, Chinese patent medicine
柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖（2→1）-α-L-鼠李糖，分子式
C27H32O14，分子量580.55[1]。

相关研究表明，研究表明，柚皮苷在降血脂[2]、抗氧化[3]、抗菌消炎[4]、抗肿瘤[5]、抗过敏[6]、抗关节炎镇痛[7]、抗心血管疾
病[8]及其他多方面[9]具有较强的生物活性，是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中
药[10]的主要有效成分之一。

柚皮苷的含量是衡量这类中药的重要指标之一，目前定量测定柚皮苷的方法
有分光光度计法[11]，高效液相色谱法[12]，分光光度计法不能排除结构类似物的
干扰，很难精确定量；密度较差，干扰因素过多；虽然液相色谱已经广泛用于测
定中药中的柚皮苷，但这些方法大多数都是针对某一种中药中的柚皮苷含量的测定，方法的适用性受到限制。

因此，开发一种具有较广泛用途的中药柚皮苷测定
方法，对于利用液相色谱法分析定量柚皮苷含量，以此评价中药质量的具有重要
的意义。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪（包括Waters 1525 BinaryhPLC泵，Waters 2487 紫外
检测器，Waters System Breeze 数据处理工作站）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；eppendorf离心机。

香橼、枳实、橘红购于樟树药材市场；四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生
丸分别购自不同的医药批发公司。

柚皮苷标准品（sigma公司）；甲醇、乙腈、四氢呋喃（色谱纯,美国TEDIA
公司）。

1.2 样品处理
1.2.1 标准品溶液的制备
精确称取柚皮苷标准品0.0048g，溶于甲醇并定容至10ml，分别用甲醇稀释
制成一定浓度的标准溶液。

1.2.2 样品溶液的制备
称取一定量的实验样品，粉碎过100目筛，烘干至恒重，称取1g先用乙醚进行索氏抽提去除脂肪类物质，再用50mL丙酮浸提，共浸提3次，合并3次浸提液，旋转蒸发浓缩至干，加入50mL的甲醇溶解并定容至200mL，再经0.45μm针头式微孔过滤器过滤后备用。

1.3 色谱条件
色谱柱为Symmetry C18柱，流动相是甲醇:乙腈:磷酸缓冲液（0.01mol/L
pH3.5）=9:3:8（V/V），流速1.0ml/min，检测波长280nm，柱温35℃。

2 结果与分析
2.1 方法的定性分析
图1是柚皮苷标准品及7种分析样品的色谱图。

由图1可知，柚皮苷的出峰
时间为2min左右，所试验的7种中药的杂质峰与柚皮苷的峰得到了较好的分离，说明方法的适用性较好。

图1 样品的HPLC色谱图
Fig 1.HPLC chromatogram of samples
注：图中A、B、C、D、E、F、G、H分别是柚皮苷标准品，枳实、橘红、香橼、四磨汤、橘红丸颗粒、胃痛丸、抗骨增生丸的液相色谱图。

2.2 标准工作曲线及检测限
精密吸取柚皮苷的标准样品的梯度稀释样，在选定的色谱条件下进样20μl进
行分析，以柚皮苷的浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，
并计算其回归方程。

结果表明，在1.8-350mg/L的浓度范围内，柚皮苷分析测定
的标准工作曲线的回归计算方程为y=42381x，回归方程的R2值为0.9999，说明
在此浓度范围内线性关系良好。

基线噪音峰面积响应值为6110，以3倍噪声计算
检测限，则柚皮苷的检测限为0.43mg/L；以10倍噪声计算方法的定量检测限，
则最低定量检测浓度为1.44mg/L。

2.3 准确度
采用回收率进行方法准确度的评价，分别称取不同柚皮苷标准品，用丙酮提取，浓缩后用甲醇溶解定容，用液相色谱测定其浓度，以计算其回收率,结果如表
1所示。

由表1可知，在1.44-328.75mg/L浓度范围内，柚皮苷的回收率处于
99.53%-102.14%之间。

表1 回收率试验结果
Table 1 Result of recovery test
2.4 精密度
分别以4种中成药为本底，加入一定的柚皮苷，用液相色谱检测，每个样品
溶液5个平行样，计算相对标准偏差，结果如表2所示。

相对标准偏差都小于5%，说明样品的精密性良好。

表2 样品精密度实验结果
Table 2 Result of precision experiment
注：样品1是以抗骨增生丸为本底；样品2是以四磨汤为本底；样品3是以
橘红丸颗粒为本底，样品4是以胃痛丸为本底。

2.5 几种原料中药柚皮苷含量的测定
对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表3所示。

由表3可知，不同原料药中的柚皮苷浓度差别较大，香楷中柚皮苷含量为2.89-5.67%，不同产
地香橼的柚皮苷含量差别较大，其相对标准为28.88%；枳实中柚皮苷的含量为
0.21-0.26%，不同产枳实中柚皮苷含量的相对标准偏差为10.63%；橘红中柚皮苷
的含量为1.97-3.31%，不同产地橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差为26.42；这说明，产地不同的原料药中柚皮苷的浓度具有较大的差异，这种差异在香橼及橘红
中非常明显。

表3 几种原料药中柚皮苷含量测定结果
Table 3 analysis results of naringin content of law Chinese medicine
2.6 几种中成药柚皮苷含量的测定
对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表4所示。

由表4可知，四磨汤中柚皮苷的含量为5.99mg/g，胃痛丸中柚皮苷含量为2.25mg/g，橘红丸颗
粒中柚皮苷含量为1.71mg/g，抗骨增生丸中柚皮苷的含量为0.30左右。

不同厂家生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差
分别为8.43%、14.72%、9.90%和3.42%，与中药原料中柚皮苷的含量差异较大相比，不同厂家生产的中成药中柚皮苷含量相对稳定。

表4 几种中成药中柚皮苷含量测定结果
Table 4 analysis results of naringin content of Chinese medicine
3 结论
3.1 建立了利用液相色谱法测定中药中柚皮苷的方法，用Symmetry C18柱，
在甲醇：乙腈：磷酸缓冲液（0.01mol/L pH3.5）=9:3:8（V/V）、流速1.0ml/min、柱温35℃的条件下进行分离，在280nm波长条件下检测，柚皮苷的出峰时间为
2min，柚皮苷与杂质得到了很好的分离。

方法的标准曲线回归方程为：y=42381x；方法的检测限为0.43mg/L，定量检测浓度为1.44mg/L；柚皮苷的回收率在99.5%-102.5%之间，相对标准偏差小于5%。

3.2 几种含柚皮苷的中药原料中，香橼中的柚皮苷含量最高，枳实中含量相对
较低；不同产地的中药原料中柚皮苷的含量并不相同。

3.3 几种中成药中柚皮苷的含量差别较大，其中四磨汤中柚皮苷含量相对较高，不同厂家生产的中成药中柚皮苷的含量相对较稳定。

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