重组人甲状旁腺素1-34胰蛋白酶切肽图谱分析

品间 同 一 性， 是评价生产工艺稳定性的重要指 标 ， 已用于许多重组 <E4 产品的质量控制 。 本文采用胰蛋白酶切 G-",-./ 法对 9:-0, !"#$ 进 的一级结构和不同批产品间一级结构的一致性。 实验结果显示， # 批样品的肽图谱 均 与 对 照 品 一 致， 建立的肽图谱测定方法简便、 准确、 重现性好， 可有效控制产品的质量。 ! 仪器与试药 包括： 低压四元 4D67>C? !!’’ 高效液相色谱仪，
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行肽图分析， 并与对照品的肽图比较， 以确证产品
万方数据
【" 通讯作者】 0>7： ’&’"5*)’#$’(
第%期
曾文珊等： 重组人甲状旁腺素 %:,1 胰蛋白酶切肽图谱分析
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流速： 柱温： !"# 。检测波长： $%& ’(； % () * (+’； ,& ； 进样量： 。 &" ! ) $.$ 溶液的配制 （ 40 5.&） 取 /01 023, % 6， %# /01 023, 溶液 加纯水 %"" () 溶解， 用氨水调节 40 为 5.&， 用 ".1& 备用。 ( 滤膜过滤， ! 胰蛋 白 酶 溶 液 取 7829:胰 蛋 白 酶 适 量， 用 （ 40 5.&） 溶液溶解制成浓度为 % (6 * %# 碳酸氢铵 分装后放入 ; $" - 冰箱冷冻， 备用。 () 的溶液， （ %:,1） 对照品 870 %:,1 对照品溶液 取 870 一支， 加纯水 % () 溶解， 分装后放入 ; $" - 冰箱冷 冻， 备用。 $., 酶解反应 分别取连续生产的 , 批样品原液和对照品溶 液各 $"" ! （浓度约为 ， 各加 %# /01 023, ) % (6 * ()） 溶液 （ 40 5.& ） 按 % < $& （ ! " !） 比例加入 1"" ! )， 混匀， 7829:胰蛋白酶溶液 5 ! )， ,= - 水浴保温 1 >， 取出， 加入冰醋酸 ," ! 混匀， 置 ; $" ) 终止反应， 冰箱冷冻备用。 另取 %# /01 023, 溶液 （ 40 5.&）1"" ! 按 %< )， （ ! " !） 比例加入 7829:胰蛋白酶溶液 5 ! $& )，加入 冰醋酸 ," ! 混匀， 同法操作， 作为酶解空白。 )， $.1 纯度分析 取原液适量， 加水制成每 % () 中含 ".$& (6 的 溶液， 取 &" ! ) 注入液相色谱仪，用程序 % 梯度洗 脱， 记录色谱图；另取对照品适量， 加水稀释至同 一浓度， 同法测定， 按外标法以峰面积计算。 $.& 肽图分析 分别取 经 酶 解 后 的 样 品 和 对 照 品 溶 液 各 &" ， 注入液相色谱仪， 用程序 $ 梯度洗脱， 记录色谱 ) ! 图。
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学 报
#$%&’() $* +,-’( .,(&/(01%2-0() 3’-41&5-26
第 (4 卷
!
讨
wenku.baidu.com
论
本文分别选用 !" #$% $&’（ 和三羟 !） ( )$ *+,） 甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液 （ )$ *+,） 两种缓冲液进 行酶切试验。肽图测定结果显示， 后者比前者的酶 切肽图缺失 .、 而采用 !" #$% $&’( , 两个肽段峰， （ )$ /+%） 和 !" #$% $&’（ 溶液肽图无明显 ( )$ *+,） 差异。 0123$ !-(% 的胰蛋白酶酶切肽图理论上应 有 4 个酶切肽段峰， 考虑到胰蛋白酶的最适 )$ 值 为 *+,， 因此本文选择胰蛋白酶切反应的缓冲液为 。 !" #$% $&’（ ( )$ *+,） 在 胰 蛋 白 酶 酶 切 试 验 中，本 文 采 用 !" （ )$ *+,） 为酶切反应缓冲液， 冰醋酸 #$% $&’( 溶液 分别考察不同酶与蛋白质的比例 (5 ! 6 为终止液， 和酶切反应时间的肽图。结果显示， 当酶与蛋白质 的比例 （ ! " !） 分别为 ! 7 !55、 酶切反 ! 7 ,5、 ! 7 ., 时， 应达到稳定的时间分别为 4， %， . 1。为了尽可能缩 短酶切反应时间， 又能保证反应完全， 本文选择酶 与蛋白质的比例为 ! 7 .,， 反应时间 % 1。 在实验中曾尝试采用 ,5" 冰醋酸 (( ! 6 为终 止剂， 测定结果表明不能完全终止反应。改用冰醋 酸 (5 ! 结果表明能完全终止反应， 不 6 为终止剂后， 再出 现 酶 切 肽 段。 此 外， 还考察采用三氟乙酸 （389） 磷酸 (5 ! !5 ! 6、 6 为终止剂或不加终止剂直 接置 : .5 ; 冷冻终止反应的情况， 结果加 389!5 磷酸 (5 ! 6、 6 或不加终止剂直接置 : .5 ; 冷冻均 ! 能完全终止反应， 所测肽图一致， 说明 389!5 ! 磷 6、 酸 (5 ! 6 和冰醋酸 (5 ! 6 均对肽图分析不产生干扰。 考虑到终止剂使用的经济、 方便， 最终选择冰醋酸 (5 ! 6 为酶切反应终止剂。 流动相 9、 使 .） < 中均加入了酸性很强的 389， 流动相为强酸性。本实验采用性能稳定的 =>0?@A （%+4 CC D .,5 CC， 色谱柱。该柱由 ,! C） (55-B< &!* 高纯硅胶基质制造， 具有很宽的 )$ 适用范围和很好 的分辨率， 特别适用于强酸性流动相的色谱分离。 胰蛋白酶专一作用于精氨酸和赖氨酸的羧 (） 基端， 而胰凝乳蛋白酶则专一作用于芳香族氨基酸 的羧基端， 由于二者都是从胰脏制备得到的， 不易 完全 分 离， 影 响 了 酶 解 专 一 性。 因 此 建 议 采 用 抑制胰凝乳蛋白酶活性， 保证胰 32&E-胰蛋白酶， 蛋白酶的酶解专一性。 万方数据
构的一致性。方法： 运用梯度洗脱 + 反相高效液相色谱法对样品进行纯度检查和肽图谱测定。结果： 建立了重组 建立的肽 人甲状旁腺素 !"#$ 的胰蛋白酶水解肽图谱 ,-./ 测定方法， # 批样品的肽图谱均与对照品一致。结论： 图测定方法简便、 准确、 重现性好， 适用于产品的质量控制。 【关键词】 重组人甲状旁腺素 !"#$； 肽图谱； 胰蛋白酶切； 高效液相色谱法； 一级结构 【中图分类号】 01$*’ 2 3 【文献标识码】 4 【文章编号】 !’’’")’$5 （&’’)） ’!"’’5*"’$
学报 （!） ： ZO[9CB7 O\ /:6CB -:B9ABL>[?6LB7 ]C6^>9X6?8 &’’)， #$ 5* F 5( 5* # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
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骨质疏松症已成为老年健康的主要问题之一。 传统的治疗药物有雌激素、 降钙素、 二膦酸盐等。近 几年， 国外开始在临床上使用骨形成刺激剂， 如促甲 状腺素和氟化物， 治疗效果明显。由美国 .6778 公司 开发的重组人甲状旁腺素 !"#$ （ 9:-0, !"#$） 目前已 完成!期临床试验， 并通过 ;<4 专家委员会的认证。 国内也有多家研发单位研制开发该产品用于治疗骨 质疏松症， 并已完成临床前研究。 肽图分析 （=>=?6@> AB==6CD） 是将蛋白质裂解成 小片断， 通过一定的分离检测手段形成特征性指纹
8FG (+ 2H)IFJH C@))FKG >L 013$ !-(% （ N@C)6H !， 9M NI@KJ@0J； <M N@C)6H !； &M N@C)6H .； OM N@C)6H ( .， ( 0HLH0 I> N@C)6HN PFI1 JFLLH0HKI ?@IQ1）
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小
结
本文分别探讨了酶切条件 （如酶切缓冲液种类 和 )$ 值） 、 酶与蛋白质的比例、 酶切反应时间、 终 止剂的种类和用量等对肽图测定的影响， 并确定了 建立了用 0123$ !-(% 胰蛋白酶的最佳酶切条件， R2-$2S& 法分析 0123$ !-(% 胰蛋白酶肽图的方法。 在确定的酶切条件和色谱条件下， 测定重复 ( 次进 行酶解的样品原液和对照品的胰蛋白酶酶切肽图， 结果峰数、 峰型和保留时间均一致， 各肽段色谱峰 均达到很好的分离， 表明所确定的酶切条件和色谱 条件稳定， 符合实验要求。从测定结果分析， 胰蛋 白酶酶切肽图的实际肽段数稍比理论值多， 结果理 想， 可作为确证产品的一级结构和评价不同批产品 间结构一致性的质控方法。对色谱图中各酶切肽
・ 技术交流 ・
重组人甲状旁腺素 !"#$ 胰蛋白酶切肽图谱分析
曾文珊!%& ， 刘景晶!， 杨仲元&， 徐康森#
& 广州市药品检验所， （! 中国药科大学生命科学与技术学院， 南京 &!’’’(； 广州 )!’!*’； #
!
中国药品生物制品检定所， 北京 !’’’)’）
【摘
以确证一级结构和比较不同批产品间一级结 要】 目的： 对重组人甲状旁腺素 !"#$ 进行肽图谱测定，
! ,.%
实验结果 鉴定和纯度分析
主峰纯度按峰面积归一化法计算， , 批样品原 液的 纯 度 分 别 为 S=.$# 、 均大于 S!.S# 、 S!.S# ， 符合肽图谱分析对样品纯度的要求。样品具 S&# ， 有相同的保留时间， 显示了同样的极性。 ,.$ 肽图分析 @>870 %:,1 的 胰 蛋 白 酶 酶 解 位 点 如 下： TUTRVWLX0/LY9! 0L/TXRZ ! UR[LZ ! 9 ! 9 ! （用箭头代表酶解位点） ， 共有 & 个酶解 LWQU0/? 位点， 理论上应得 ! 个酶解肽段 7%、 7$、 7,、 71、 7&、 即残基 %:%,、 7!， %1:$"、 $%:$&、 $!、 $=、 $5:,1。实际上 从 08L2 色图谱上得到 = 个肽段峰， 连续生产 的 批样品原液胰蛋白酶酶解肽图与 , @>870 %:,1 对 照品完全一致 （见图 ,） 。
! 【收稿日期】 &’’$"’("’3 ［#］ ［$ F 3］
色谱柱： （$%* " ； NO9PBQ #’’"JR /!5 A S &)’ AA） 流动相 4： 水"三氟乙酸 （!’’ T ’%!） ， 流动相 R： 水 "乙 腈"三氟乙酸 （ !’ T (’ T ’%!） ， 二元梯度洗脱， 程序 ! （纯度分析） ： 流动相 R 的浓度 &’H F ’ F !$ A6C， 流动相 R 的浓度 #’H F *’H ； #’H ； !$ F &’ A6C， &’ 流 动 相 R 的 浓 度 *’H F 5’H ； F && A6C， && F &# 流动相 R 的浓度 5’H F &’H ， 流 A6C， &# F #’ A6C， 动相 R 的浓度 &’H 。程序 （ ： & 肽图分析） ’ F ) A6C， 流动相 R 的浓度 ’H F !’H ； 流动相 R ) F $’ A6C， 的浓度 !’H F #’H ； 流动相 R 的浓度 $’ F $) A6C， 流动相 R 的浓度 $’H F #’H F $’H ； $) F $3 A6C，
［!］ 图谱 。肽图分析可作为重组 <E4 产品与天然产 ［&］ 品或对照品精密比较的手段 ， 也可反映不同批产
梯度泵、 可变波长紫外检测器、 柱温箱、 带恒温单元 的自动进样器、 在线真空脱气机。4D67>C? 化学工作 站。 （规格为 ! AD + A7） ； 对照 9:-0, !"#$ 原液 # 批 品甲 状 旁 腺 素 !"#$ （ -0,!"#$， 纯 度 ((H ， 规 格： ! 批号： ； AD + 支， !’/I$()$!， J6DAB 公司） !（对甲苯磺 " 酰） 苯丙氨酰氯甲酮 （ 0-/I ） 处理过的胰蛋白酶 （ J6DAB 公司） ； 三氟乙酸 （ 0;4， ； 乙腈为 K>9LM 公司） 色谱纯， 其他试剂均为分析纯。 " &%! 实验方法 色谱条件