反义核酸药物剖析

二级结构，它类似于能促使转录作用终止的柄 - 环结构，
空间构象障碍迫使 RNA 聚合酶脱离 DNA 模板，停止转录。
3、在翻译水平上（主要调控形式）：
主要表现在三个方面： 1、一是与mRNA5’-端非编码区（包括Shine—Dalgarno， SD序列）序列结合，直接抑制翻译； 2、二是与mRNA 5’-端编码区，主要是起始密码AUG 结合，抑制翻译起始； 3、三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构 象改变，影响它与核糖体的结合，间接抑制了mRNA的

导入方法
1、RNA病毒感染;
2、脂质体包裹反义寡核苷酸； 3、显微注射; 4、逆转录病毒; 5、腺病毒介导等方法。
此外 ,利用抗体、阳离子多肽、维生素等也可增加 as
ＯＮ到达靶细胞的能力。
四、 反义核酸类药物必需符合的条件
1、选择性(ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ)
目前,许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此, 只对其ｍＲＮＡ序列选择一个区段，设计所要合成的反
第2条途径------糖环修饰:
糖环修饰包括α构型、1’位取代、2’位取代、3’- 3′
连接、5’＿ 5′ 连接等。原理是使核酸酶不能有效识别
磷酸二酯键。 α构型修饰: 是指将天然ＤＮＡ或ＲＮＡ的β型糖苷键替 换成α构型,使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。
1’位取代、2’位取代:
指将戊糖的1′ 2′位引入某些取代基。
（2）骨架修饰
第1条途径-------磷的修饰:
磷原子是核酸酶的主要攻击位点 ,修饰后效果明显。 磷的修饰包括硫代、甲基化、氨化、酯化等,尤以硫代 磷酸寡核苷酸 (phosphoroth-ioteoligonucletide,PS-ODN) 最为常用,称为“第一代反义药物”。
PS-ODN 是至今研究最深入、应用最广泛的一类
I（反义RNA）实现抑制作用。
该质粒复制起始时，引物 (RNA II) 与其模板链结合， 并在 DNA 聚合酶参与下合成新的 DNA 子链。但是很快就 有一种长约100个核苷酸的反义RNA分子 (RNA I) 生成。 RNA I与RNA II -552----447核苷酸互补,且互补区位于复制 起始位点上游,它在Col E1复制过程中能与 RNAⅡ的5’-末
如烷基、烷化剂等。嵌入特殊功能分子后 , 也使 as ＯＮ具 备更强的核酸酶抗性，但不影响亲和力。
3′＿3′
5′＿5′连接修饰: 考虑到核酸酶只识别3′ ,5′磷酸二
酯 键 , 故 合 成 一 类 具 有 3′ ＿ 3′ 5′ ＿ 5′ 颠 倒 连 接 末 端 的 asON(ＩＮＶ＿asON),结果使核酸酶不能识别。
义ＤＮＡ/ ＲＮＡ序列。这些区段主要包括:
5′端帽子结构区; ｍＲＮＡ的起始编码区或编码区; 核前体ｍＲＮＡ的拼接区; 反转录病毒的引物区等。
这些区段均为基因表达的关键区或敏感区,对基因的 调控起重要的作用。
一般而言 , 只要人工设计合成 15----20 个碱基长度的
反义ＤＮＡ或反义ＲＮＡ,就足以使此反义核酸与靶ｍＲ ＮＡ形成结合作用,且这种结合调节是非常特异性的。
使蛋白质的表达受到抑制。
核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)技术
核酶是一类本身具有酶的剪切活性的ＲＮＡ ,也是反 义技术的一部分,它能序列特异地催化切割靶ＲＮＡ ,故 也可用来封闭ＲＮＡ的功能。
核酶的作用原理 为核酶的特异性序列通过互补碱
基对形成识别并结合特异性靶ＲＮＡ ,故可以人工设计 针对某一靶ＲＮＡ的核酶,破坏靶ＲＮＡ。 近来还有人将多个不同的核酶连接在一起使切割效 率大大提高,已试用于临床,其治疗范围也已从单基因疾
Replicon
Origin
RNAI
RNAII
2、在转录水平上：
反义RNA可与mRNA 5’-端互补,从而阻止了RNA的完
整转录。

大肠杆菌的cAMP受体蛋白基因（CRP)的转录会受到一种 小分子反义 RNA 的制约。这种反义 RNA 可与 CRP 基因转 录起始生成的 mRAN 分子的 5’- 端序列互补，形成特异的
转运。
3、RNA杂交分子不稳定，易被核酸酶降解。 4、反义 RNA与胞质中成熟的 mRNA杂交，抑制其翻译成蛋
白质。
三、反义药物的特点,设计和导入方法

1.
特 点
选择性强: asON只作用于靶基因,不与非相关基因作用, 特异性高，且片断短,合成方便、经济;
2. 3.
效率高: asON几乎可以完全阻断靶基因的翻译; 低毒: asON作用于局部,对全身影响小。
治疗已有进展。将核酶基因以合适的载体导入细胞内， 在细胞内转录产生核酶，从而发挥抗病毒作用。
反义RNA调节翻译的基本原理是：
1、反义 RNA与 mRNA 有互补序列，根据碱基互补原则，能
相互结合，形成 mRNA- 反义 RNA 杂交体，阻断 mRNA 的翻
译。 2、反义 RNA和 mRNA 的结合可发生在细胞核中，也可发生 在细胞质中。如发生在核中，就会干扰mRNA的加帽和加尾 以及剪接和加工过程，也会干扰mRNA从细胞核向细胞质的
反义核酸药物是药理学的新领域或革命:
新的药物——反义寡核苷酸
新的药物受体—— mRNA 新的受体结合方式——Watson-Crick杂交 新的药物受体结合后反应: （1） RNase H介导的靶RNA 的降解；
（2）抑制DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译
等。
设计
1. 能特异地识别靶基因,并能与之稳定结合; 2. 有较长的半衰期及较强耐受核酸酶消化的能力; 3. 能通过靶细胞膜,有效的到达作用部位。
国外已有反义药物应用于临床 , Ｓｃｉｅｎｃｅ 杂志 1998 年 7 月报道了第一个通过ＦＤＡ认证的反义 药物 , 即用于治疗艾滋病人巨细胞病毒感染的视网膜 炎的福米韦生(Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ, Ｖｉｔｒａｖ
ｅｎｅ),这是ISIS公司的一大成果, 此外还有多种反义
药物包括核酶在内的新一代反义药物进入临床。
反义核酸药物
一、概述

1967 年， Belikova 等提出了利用一段反义寡核苷酸来
特异性地抑制基因表达的设想。

1978 年， Zamecnik 和 Stephenson 利用一段长 13 个碱基
的反义DNA寡核苷酸链成功地抑制了劳斯（Rous）肉瘤
病毒的复制，引起人们极大的关注。

1981年Tomizawa第一次报道了天然反义RNA的生物学
asODN ，它有效增强了对核酸酶稳定性、具有良好的 水溶性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。
PS-ODN与天然ODN相比：
通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长最
终细胞内浓度也更高；
t1/2 一般都大于 24h ，极大的提高了对核酸酶的耐受
力； 但由于 PS-ODN 其本身带有大量的负电荷，能与 多种因子结合从而导致非特异效应。在体内表现出剂 量依赖的毒副作用。
假肽取代磷酸二酯键后其： 特异性更强，
带电荷少、
不被蛋白酶和核酸酶识别, 亲和性更高, 副作用减少。 具有比前两代反义寡核苷酸更好的亲和力和至少
相同的序列特异性，而且也有相当的抗病毒活性。称
为第三代反义核酸。近来这种肽核酸研究很多。
第4条途径----构建嵌合体结构的反义核酸
即综合应用多种化学修饰 , 效果很好 , 有“第二代
高的特异性。
1、有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，设 计、合成特异性的反义核酸比较容易； 2、反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特 异和有效的结合，从而调节基因的表达。
缺点是： 天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一
旦进入又容易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。 为此，人们采用药物化学的原理和方法，对天然寡核苷 酸进行化学修饰，以达到治疗药物的要求。
病扩大至多基因疾病。
另外,在核酶基础上,人们又提出了反义核酶的概念,即 通过基因连接将反义ＲＮＡ与核酶的基因连为一体 , 再 转录得到具有双重功能的一类ＲＮＡ分子 ,对靶基因既 有封闭作用 ,又有切割作用。目前核酶在基因治疗领域 中颇受瞩目,属研究热点。
核酶药物
近年来利用反义核酸和核酶进行抗病毒
2、稳定性(ｓｔａｂｉｌｉｔｙ)
asON 的功能在很大程度上取决于其稳定性 ,asOD 在体内生理条件下,很容易被各种核酸酶降解 ,这样就根 本无法达到阻遏ｍＲＮＡ翻译的目的。因此 ,人们对反 义核酸的结构进行各种 化学修饰 以提高其稳定性 ,增加
对核酸酶的抗性。
（1）碱基修饰：
碱基是asON与靶基因通过氢键形成而直接接触的
RNA的加工与成熟。
反 义 寡 聚 核 苷 酸 （ antisense oligonucleotides ，
asON ）：目前研究的热点。是一小段与 mRNA 或 DNA 特
异性结合并阻断其基因表达的人工合成的短核酸片断。
反义核酸技术： 是指利用反义核酸的特异性来抑制
某些基因表达技术。
反义药物：利用这一技术研制的药物。
端互补结合，使其构型改变，从而阻碍了 RNAⅡ与DNA模
板链的结合，RNAⅡ不再起到引物的作用，质粒DNA的复制 终止。 见图示：
Replication of the ColE1 Plasmid
ColE1 replication is unidirectional
Colicin
ColE1 (6646 bp)
第3条途径-----肽骨架
基于asON发挥特异性抑制基因表达的关键在于其 碱基排列顺序 , 而与易于降解的磷酸和糖环组成的磷酸 二酯键骨架无关。所以,asOD的磷酸-糖骨架以肽键取代，
得到新型的化合物----多肽核酸(ｐｅｐｔｉｄｅ
ｃｌｅ ｉｃ ａｃｉｄ, ＰＮＡ)。
ｎｕ
由于结构上 PNA 与 DNA 类似，其两相邻碱基间距 及碱基与类肽链骨架间的距离均相近， PNA 与 DNA 以 及RNA与PNA之间均可形成碱基配对。
难杂症的新型药物。反义技术正孕育着药物学和药理学
上的一次革命。
反义核酸：是指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之
特异性结合的一段DNA或RNA。
பைடு நூலகம்一般包括:

反义DNA（antisense DNA）
反义RNA（antisense RNA） 核酶（ribozyome）: 是具有酶活性的RNA，主要参加
部位,而氢键的形成又是asON发挥功能的必要条件。因
此,该部位的修饰应以不影响氢键形成为前提。任何影 响A-T（U）/G-C碱基配对的修饰都会因碱基错配而导
致asON与靶基因的结合或特异性降低或丢失。
如： 1、在胞嘧啶的5位点甲基化（最常使用） 2、使用三氟甲基、咪唑丙基、炔丙基等。
-CH3
DNA chain
翻译。
GGAGG
真核细胞中反义RNA除了上述三个水平发挥作用外，
在下列阶段也呈现功能： 1、作用于mRNA 5’-末端，阻止帽子结构的形成； 2、作用于外显子和内含子的连结区，阻止前体mRNA的剪 接； 3、作用于PolyA形成位点，阻止mRNA的成熟及向胞浆的 转运； 4、与mRNA结合，使得mRNA易被酶识别而被降解，从而
二、反义药物的作用机理
反义核酸可在复制、转录、剪接、转运和
翻译 等各个环节上发挥调控作用。
其机制为：
1、在DNA复制水平上：
反义 RNA 可作为 DNA 复制的抑制因子，它可与引
物 RNA 互补结合，抑制 DNA 的复制，从而控制复制频 率。
例如： 大肠杆菌质粒Pmb1(Col E1)复制是通过 RNA
反义核酸可特异性地作用于靶基因或 mRNA ，从基因
复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基 因的表达，从而实现疾病的治疗。
药物的研究与开发取决于两个重要的参数：
1、确定疾病发展过程中的合适靶点；
2、发现能特异性识别并能与该靶点结合的化合物，从
而干预疾病的发展过程。
反义寡核苷酸作为药物比常规药物的治疗有更
反义药物”之称。它以 PS-ODN 为核心，两翼序列上 的核糖的2’ 位被其它基团修饰。除了化学修饰，还可
功能，发现在质粒DNA复制时，与引物RNA互补的RNA 分子能抑制DNA复制。

1983年 Mizuno 和 Simon等同时发现反义 RNA的调节作
用，进而揭示了一种新的基因表达调节机制。

20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，反义
核酸的研究快速发展起来。有人将它与20年前单克隆抗 体的问世相比拟，认为该项技术的成熟化有望获得一类 可以“根治”肿瘤、遗传性疾病、病毒性疾病等多种疑