结核病实验室诊断技术新进展

培养
染色
脱色
复染
identification by biochemical or serological tests on pure growth
from single colony
on plates or in broth
33
一、目前实验室常用检测方法
2、免疫学方法 抗体检测是结核病辅助诊断手段， 对菌阴肺结核有
中盖项目LED评估结果
初诊患者 LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼
氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000 ） 随访患者 LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509) 和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000 ）
中盖项目LED评估结果
读片时间 LED 读片时间120.03±38.88秒，明场显微镜
206.31±75.86秒（p=0.00） 使用接受度调查 对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广
，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使 用
二、 新诊断技术和方法
2、免疫学方法： -干扰素释放实验
1155
二、 新诊断技术和方法
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan
• 可同时检测患者是否感染结核
所用仪器设备极其简单 63 ℃扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物
突变检测 胞壁成分检测 88
二、 新诊断技术和方法
1、细菌学检查 发光二极管（LED）荧光显微镜
光源寿命长（30,000h） 不需要预热 不需要暗室 可用现有的显微镜 可使用电池电源
与通常荧光显微镜的判定一 致率98.0%Hale Waihona Puke Baidu
99
二、 新诊断技术和方法
两种方法观察结果
Z-N染色镜检结果
LED镜检结果
•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 •密闭系统(没有污染的风险） •快速，两小时内即可得到检测结果， •肉眼观察
1166
二、 新诊断技术和方法
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)
临床标本（咯痰等）
标本处理
Extraction solution 1 and 2
Who policy statement， June 2008
1199
二、 新诊断技术和方法
3、分子生物学 （2） 线性探针检测技术（LPA）
耐药分子诊断的基本原理 利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点 的突变相关。
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二、 新诊断技术和方法
分类
新方法
细菌学检查 LED(发光二极管显微镜)
用途
涂片检查
免疫学方法 分子生物学
其他
-干扰素释放实验 LAMP( 等温扩增) LPA( 线性探针) Genechip(基因芯片) GeneXpert(多色巢式定量PCR) 分子分型技术
DNA 测序法 HPLC
潜伏感染者
涂阴\涂阳 MDR-TB, 鉴定 MDR-TB, 鉴定 耐RFP, 涂阴 指纹图谱分析
一定的参考价值。 1、酶联免疫吸附试验 2、免疫胶体金标技术
44
5
潜伏结核感染者的筛查 结核菌素PPD试验
6
一、目前实验室常用检测方法
3、分子生物学方法 ✓ 实时荧光定量PCR技术：也称分子信标技术，是今年发展起来的核酸定量
技术。是PCR与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的 高特异性相结合。 ✓ PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为 一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针 完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶 的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个 荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
主要内容
结核病实验室常用的诊断技术和方法 结核病实验室新的诊断技术和方法 未来实验室结核病的诊断模式
1
一、目前实验室常用检测方法
1、细菌学方法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法
22
一、目前实验室常用检测方法
1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）
显微镜检查
unstained or stained with e.g. Gram stain
PCR
LAMP
・需要使用PCR扩增仪 ・设计特异性的两条引物 ・扩增效率:107
・不需要使用PCR扩增仪
・多对引物保证扩增的特异性
・扩增效率:1010
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二、 新诊断技术和方法
3、分子生物学
（2） 线性探针检测技术（LPA）
✓可进行结核杆菌复合群的鉴定 ✓可用于MDR-TB高危人群的筛查 对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变) 对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最 常见突变) ✓检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本 ✓内部控制保证了结果的正确 ✓可以获得商品化的试剂盒 ✓约五小时内即可得到检测结果 ✓需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室 ✓需要至少三间房子
抗原
IFN-
单核细胞分离
YYYY
TB抗原刺激，IFN- 释放
YYYY 一抗捕获IFN-
YYYY YYYY
YYYY 与标记的二抗结合
YYYY
酶作用标记物－显色
每一斑点代表释放 IFN-的一个细胞
1133
BCG进化过程
二、 新诊断技术和方法
分子生物学
✓ LAMP( 等温扩增) ✓LPA( 线性探针) ✓Genechip(基因芯片) ✓GeneXpert( 多色巢式定量PCR) ✓分子分型技术
DNA提取
10min ,100℃
1min ,2000g
Supernatant，capture DNA
基因扩增
LAMP amp4l0ifmicianti,o6n7℃
Reconstitute reaction mix
基因检出
＋－
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二、 新诊断技术和方法
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)