双向凝胶电泳
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同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
析
的进一步
流
验证
程
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备
凝胶中的蛋白
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 N端测序
数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后双修向凝饰胶电的泳鉴定
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶wenku.baidu.com泳
20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS)
(Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H.
随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。
此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一
般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质
点。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。
Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程
双向凝胶电泳
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求 流程 技术路线
双向凝胶电泳
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die
anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。
1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化， 建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；
双向凝胶电泳
生物学问题 的提出
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
蛋白点 的切取
图像扫描和初步分析
蛋
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
白 质
组
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 双向凝胶电泳
分
其它实验
析
的进一步
流
验证
程
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备
凝胶中的蛋白
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 N端测序
数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后双修向凝饰胶电的泳鉴定
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
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20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS)
(Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H.
随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。
此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一
般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质
点。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。
Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程
双向凝胶电泳
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求 流程 技术路线
双向凝胶电泳
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die
anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。
1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优化， 建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；
双向凝胶电泳
生物学问题 的提出
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
蛋白点 的切取
图像扫描和初步分析
蛋
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
白 质
组
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 双向凝胶电泳
分
其它实验