高效液相色谱定性定量分析方法

流动相：乙腈－水－三乙胺
(60：40：0.2，V/ V/V）；
紫外检测波长265nm；
流速0.7mL·min-1；
进样量10μL;
5
min
柱温：室温
定性分析—保留值定性
2 利用文献保留值数据进行比对定性
` 文献报道的保留值数据只能作为定性参考
` 液相色谱柱填柱技术复杂，重现性差；条 件不允许，难以得到相同色谱条件（仪器 、色谱柱、试剂等）
` 对内标的要求
化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 不存在于待测样品中 不与样品组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 与其他组分分离良好 理化性质与待测组分相似，有相似分离萃取性质
定量分析-标准加入法
` 也称叠加对比法，实际上是一种特殊的内标法
` 是在选择不到合适内标时，以待测组分的纯物质 为内标，加入到待测样品中
Minutes
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
4,000
响应值 3,000 (峰面积)
2,000
标准曲线
1,000
0
0
50
100
150
200
250
样品浓度
定量分析--标准曲线法
` 优点：简单 缺点：适用范围窄；必须有标准物质
定性分析—保留值定性
例：
120000 100000 80000 60000 40000 20000
0 0
Agilent 1100 SeriesHPLC仪;
氨脒标准品 未知化合物
Agilent Zorbax Extend-C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm);
定性分析—两谱联用定性
` 1983年开发串联质谱技术问世，发展十分迅速， 已被作为成熟技术，广泛用于许多领域，特别是 药学领域，并发挥了巨大作用
` 中药及植物药化学成分的快速筛选； 中药品种、道地药材的鉴别； 中药质量标准研究； 药代动力学和药物代谢产物研究； 非法掺假； 刑事侦察；兴奋剂筛查；环境保护
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确Hale Waihona Puke Baidu为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
定量分析--归一化法
` 所有出峰组分之和按100%计算的定量方法，称为 归一化法。
` 前提条件是样品中所有组分均能流出色谱柱，并 在检测器上都能产生信号。
` 组分i 的质量分数可按下式计算：
式中Ai为组分i 的峰面积， f’i为i 组分的质量校正因子。 当fi为摩尔校正因子或体积校正因子时，所得结果分别为 i 组分的摩尔百分含量或体积百分数
定性分析—两谱联用定性
` 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、 理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至 相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问
` 红外光谱、紫外光谱、核磁共振波谱和质谱对 有机化合物有很强的定性能力，可用于定性
` HPLC-紫外光谱已作为液相色谱的常规检测器使 用；HPLC-MS和HPLC-NMR也十分成熟
定性分析—两谱联用定性
志愿者口服三苯双脒肠溶片后尿样一级全扫描色谱图
x10 7 + TIC Scan scan-blank.d
2 1.5
1 0.5
空白
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Counts vs. Acquisition Time (min)
x10 7 + TIC Scan scan-volunteer2.d
定量分析--归一化法
特点：
1 各组分须全部流出，并在检测器产生信号 2 与进样量无关 3 不需标样 4 简单
定量分析--标准曲线法
` 标准曲线法/外标法
储存标样
工作标样
0
1
2
3
4
增加溶质的浓度
定量分析--标准曲线法
实际色谱图 `
0.30
0.30
0.30
0.25
0.25
0.25
0.20
0.20
0.20
0
1
2
3
4
增加溶质的浓度
内标样浓度不变
定量分析-内标法
`
实际色谱图
mV 30
20
10
0 0.0
mV 30
20
10
X
IS
0
5.0
10.0
min 0.0
mV 30
20
X
5.0
10
IS
0
10.0
min 0.0
X
IS
5.0
10.0
min
50 40
标样峰面积 30 内标样峰面积 20
10 0 0
50
100
150
` 然后在相同色谱条件下，根据待测组分加入纯物 质前后所测待测组分的峰面积，计算含量
定量分析-标准加入法
` 优点：
不需另外的内标 不需精确进样 操作简单
` 缺点：
须保证加入待测组分前后色谱条件完全一致
谢 谢！
` 计算公式
` 特点
校正因子∶RF( Xi )
=
标样浓度C( X i ) 标样响应值R( X i )
未知组分浓度∶ Ci = RF( Xi ) × 样品响应值Ai
需要标样 标样及样品测定的条件须一致 进样体积须准确
定量分析-内标法
` 配制一系列浓度的标样，其中加有内标
储存标样 + 储存内标样
工作标样
1
0.5 178.1
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500
Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
疑似代谢物子离子扫描质谱图
x10 4 + Product Ion:2 (2.477-3.282 min, 24 scans) (220.0 -> **) pro-volunteer2.d 175.1
` 适于官能团定性
定量分析
定量分析
` 常用定量分析方法 归一化法 标准曲线法 内标法 标准加入法
按测量参数分为峰面积法和峰高法
定量分析
` 色谱定量分析，峰高法或峰面积法的选择主要 取决于检测器线性范围内，峰高和峰面积的准 确性和重复性
` 归一化法最好选择峰面积法
` 标准曲线、内标和标准加入三种定量方法可选 择峰高法和峰面积法
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
2 色谱-核磁共振联用（HPLC-NMR）
` NMR 是迄今为止功能强大的结构研究手段，可 彻底解决多数有机物的化学结构问题，且 对所 有含检测核的化合物均有响应，具有极大的通 用性
` 与HPLC 联用要求有良好的色谱分离，但对色谱 条件要求不高，普通色谱柱即可
` 适于药物杂质鉴定、药物体内外代谢产物的结 构鉴定、天然产物化学筛选等
3
2
1
10 11 12
药后
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
Counts vs. Acquisition Time (min)
定性分析—两谱联用定性
疑似代谢物峰提取质谱图
x10 6 + Scan (8.481-9.439 min, 112 scans) scan-volunteer2.d 220.1
0.15
0.15
0.15
0.10
0.10
0.10
5,000
0.05
0.05
0.05
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
定性分析—两谱联用定性
1 色谱-质谱联用（HPLC-MS）
` 质谱属于液相色谱的广适性检测器 ` 普通高效液相系统只能对已知化合物（有标准品
的化合物）通过峰位保留值定性，对未知化合物 无能为力 ` 高效液相色谱—质谱联用可对未知化合物做多级 质谱分析，通过多级质谱碎片推测未知化合物结 构，进而准确定性
高效液相色谱定性定量分析方法
郭瑞臣 山东大学齐鲁医院临床药理研究所
2009-8-26
色谱定性定量分析
` 色谱分析的目的 对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
` 根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和 该色谱峰在检测器上的响应强度，对该 谱峰初步定性和定量分析
定性分析
定性分析
` 利用保留值定性 最基本的方法； 基本依据是两个相同的物质在相同的色谱
2
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
200
250
样品浓度
标准曲线
定量分析-内标法
` 计算公式：
校正因子∶RF( Xi ) =
内标响应值R(I 标样响应值R( X
.S i)
)
×
标样浓度C
(
X
i
)
未知组分的浓度∶Ci
=
RF( X i )
× 样品峰面积Ai 内标峰面积Ai.s.
` 特点：
需要标样，需要内标
结果与进样体积无关
定量分析-内标法
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
10.00
20.00
Minutes
0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 300.00
六味地黄丸
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 Minutes
10.00
20.00
Minutes
0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 300.00
` 尽量考虑前后组分的影响，特别是分离不完全的组分 ` 只收集峰顶附近组分，以消除定性时相邻组分的干扰 ` 注意流动相中溶剂杂质的影响 ` 注意色谱分离后组分被检测和被收集间的时差
定性分析—其他方法
2 化学衍生法定性
` 利用样品中某些化合物与特征试剂柱前或柱 后存在的化学反应生成相应衍生物进行定性
` 二极管阵列检测器可同时比较保留时间和紫外 光谱图。如果两项均一样，则可基本上确定为 同一物质；如果保留时间一样，而紫外图谱有 较大差别，则判定两者不是同一物质
AU dpf - 21.902 AU AU
x - 21.894 AU
例：丹皮酚标准品
0.15
0.10
0.05
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 Minutes