不同时间修复周围神经损伤后神经生长因子含量的变化
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淋 巴细胞浸 润 ， 鞘 和轴 突变性 较 明显 。见 图 ２ 髓 。
１ 苏 木 素一 红 （ Ｅ） 色 ： 蜡 切 片 常规 脱蜡 至 ． ４ 伊 Ｈ 染 石 蒸馏 水 。苏木 素 染液 染 色 ５ｒｉ，盐 酸酒 精 中分 化 ｎ ａ ３ 。 氨 水返 蓝 ３ ， 片浸 入 伊 红 染液 内复 染 ４ ０Ｓ稀 ０ｓ切 ｍｎ 梯度 酒 精脱 水 ， 甲苯 透 明 ， ｉ， 二 中性 树 胶 封 片 ， 显
各 ５ ．在显微镜下观察 ，经图像采集仪输入计算 例 机， 每个 样 本 随 机 选 取 ５个 视 野 ， Ｉ Ａ一 ００图 用 ＭＳ ２０ 像处理软件提取各视野表达信号的灰度值 ，并计算 其平 均灰 度值 （ 灰度值 越高 ， Ｇ Ｎ Ｆ含 量越 高 ） 。 １ 统 计学方 法 ： 有计 量资 料采用 互 ｓ ． ８ 所 ± 表示 ， 免疫
中国药物 与临床 ２ １ 年 ９月第 １ 卷第 ９ Ｃ ｉ ｓ Ｒ ｍ ｄ ｓ Ｃｉｃ，ｅｔ ｂｒ ０ ｌ ！ ： ０１ １ 期 ｈｎ ｅ ｅ ｅｉ ＆ ｌｉ Ｓｐ ｍ ｅ ２ １ｏ ｅ ｅ ｎｓ ｅ ：
察。
好 ，轴突 变性 程度轻 ； Ⅱ组 神经 纤维 结 构破 坏不 明 显 ， 列 略紊 乱 ， 经 纤 维 束膜 水 肿 明显 ， 围可 见 排 神 周 淋 巴细胞浸 润 ， 鞘 轴 突变性 轻 ； 髓 Ⅲ组 可 见较 多神 经 纤维 结构破 坏 ， 排列 略紊 乱 ， 神经 束膜 周 围可 见大 量
【 ｙｗｏｄ 】 Ｐ ｒ ｈｒｌ ｅ ｅ ； Ｗｏ ｎｓ ｎ ｊｒ ｓ ｅ ｅ ｒｗｈｆｃ ｒ ｅａｒ Ｋｅ ｒ ｓ ｅｉ ｅａ ｎｒ ｓ ｐ ｖ ｕ ｄ ｄｉ ｕｉ ；Ｎ ｒ ｏ ｔ ｔ ；Ｒ ｐｉ ａ ｎ ｅ ｖ ｇ ａｏ
周 围神经 损伤 后能 否成 功再 生 ，主要 取决 于是 否 具有适 合离 断神 经生 长再 连接 的微 环境 条件 和 中 枢 神经元 活力 。而 神经 生长 因子 （ Ｇ ） 构成 良 Ｎ Ｆ是 好 微环境 的重 要 因素 ，在神 经损 伤后 具有 保护 神经 元 、 进轴 突 再生 的作 用 ＿ 。其在 微环 境 中含 量 高 促 ３ １
ｅ ｃ ａ ｂ ｔ ｆｔ ｅ ｇ ｏ ｐ ｅ ｅ ｒ ｎ ｏ ｙ ｓ ｌｃｅ ｎ ａｖ ｓｅ ｏ ｈ ｉｔｌｅ ｄ ｏ ｅ ｒ ｐ ｉｅ ｅ ｅ ｗ ｉｈ ｗ ｓ ａ ｈ ３ ｒ ｂ ｉ ｏ ｈ ｒ ｕ ｓ ｗ ｒ ａ ｄ ｍｌ ｅ ｅ ｔｄ ａ ｄ ｈ ｒｅ ｔｄ ｆｒ ｔｅ ｄ ｓ ｎ ｆｔ ｅ ａ ｒ ｄ ｎ ｒ ｈ ｃ ａ ｓ ａ ｈ ｖ
【 关键词 】 周 围神经 ；创伤和损伤 ； 神经生长 因子 ；修复
Ｌ ｖｌ ｏ ｅｖ ｒ ｗ ｈｆｃｏ ｆ ｒｐ ｒ ｈ ｒｌ ｅｖ ｊｒ ｅ ａｒａ ｉｅｅ ｔ ｉ ｏｓ ＨＵ Ｇ Ｇ ｏ ｓ ｕ， ｅｅ ｆ ｒ ｅｇｏ ｔ ｔｒａｔ ｅｉ ｅａ ｎ ｒｅｉ ｕｙｒｐ ｉ ｔ ｆ ｒｎ ｍｅｓ ｔ ｓ ｎ ａ ｅ ｐ ｎ ｄ ｔ ｐ Ａ ｕ －ｈ ｎ Ｎ ￡ Ｌ ， Ａ０Ｘ －ｅｇ Ｘ Ｎ 舰 一 ｉ． ｅａｔ ｅｔｆＯ ｔ ｐ ｅｉ ， ｉ ＯＧ ｎｒ ｏｐｔｌＴｉ ａ ３０ ３ Ｃ ｉａ ， 『 Ｙ ｕｆｒ， Ｉ Ｇ 上 ｉ ｍ ｎ Ｄ ｐ ｒ ｎ ｏ ｒ ｏ ａｄ ｓ Ｔ Ｃ ｅ ｅａ Ｈ ｓｉ ， ａ ｕ ｎ０ ０ ０ ． ｈｎ ｍ ｈ ｃ ｓ ｌ ａ ｙ 【 ｓ ａｔ ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｅ ｒ ｉｅｔｅｌ ｅ ｏ Ｃｌ ｅｖ ｒｗｈｆ ｔｒＮ Ｆ ａｅ ｐ ｉｏ ｉ ｉ ｎ ｒ ． Ａｂｔ ｃ】 ｊｃ ｖ ｏｄ ｔ ｍ ｎ ｖｌ ｆＯａ ｎ ｒｅｇｏ ｔ ａ ｏ Ｇ ） ｆ ｒ ｅ ａ ｆ ｃａｃ ｅｖ ｉ ｒ ｉ ｅ ｈ ｅ １ ｃ ｆ ｔ ｒ ｒ ｓ ｔ ｅ ｎ
Ｌ ＩＡ Ｂｏ Ｄ） 图像 摄 影 成 像 系 统 （２ —０ ００ ＥＣ ｉＭＥ ． ０ ０ ５７ １ ， Ｌ ＩＡ Ｂｏ Ｄ ， 射 电镜 （Ｅ １１）新 西 兰 白 ＥＣ ｉＭＥ ） 透 Ｊ Ｍ一 ０ １ ，
作 者单位 ：３ ０ ３太原钢铁 （ 团） ０００ 集 有限公司总医院骨科
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士 德 生物 工 程 有 限公 司 ）全 自动石 蜡 包 埋 机 （ Ｇ ， Ｅ 一
１４ Ｈ．Ｅ Ｃ ｉ Ｄ） １ ０ Ｌ ＩＡ Ｂ ｏ ＭＥ ，轮 转 式 切 片 机 （ Ｍ １５ Ｒ ２２ ，
以磷酸盐缓冲液（ Ｂ ） Ｐ Ｓ代替一抗 ］４℃过夜 。 ， 滴加相 应二抗 ，７℃，０ ４ ｎ 滴 加过 氧化 物酶标记 链酶 ３ ３ ～０ｍｉ。
兔 （ 原市 畜牧所 提供 ） 太 。 １ 新 西 兰 白兔 周 围神 经损 伤 与修 复 模 型 的 构建 ． ２ 及分 组 ： 新西 兰大 白兔 ２ ４只 ，～ ， 雄 不 限 ， ３４ 雌 切 断双侧 坐 骨 神经 ，按 组 间均 衡一 致原 则 随机 分 为 ４ 组 。 组 ６只 。 Ｉ 为第 ５天进行 神经 修复组 ， 每 组 Ⅱ组 为第 ｌ 神经修 复组 ， ５天 Ⅲ组 为第 ２ ５天神 经修 复组 ， Ⅳ组 为 即时神经修 复组 。 复后 １ ， 组 随机 抽取 修 周 各
ｐｉｏ ａ ｇｏｐ Ｉ ，１ ｇ ｕ Ⅱ）２ ｇ ｕ Ⅲ） ｒｍｍ ｄａ ｌ ａ ｅ ｉ ｕｙ（ ｏｐ Ｉ）Ａ ｗ ｅ ｔｒ ｅａ ， ａ ｎｄｙ５（ ｕ ） ５（ ｏ ｐ ， ５（ｒ ｐ ｒ ｒ ｒ ｏ ｏ ｅ ｉｅｙｆ ｒｎ ｒ ｇ ｕ Ｖ ． ｔ１ ｅｋａ ｅ ｒ ｉ ｉ ｔ ｔ ｊ ｒ ｆ ｐ ｒ
１ 材料 和方 法
３ 取修复神经段的远端 ， 只， 进行 Ｎ Ｆ免疫组织化学 Ｇ
检测 。
Байду номын сангаас
１ Ｎ Ｆ免疫组 织化 学检 测 ： ． ３ Ｇ 石蜡 切 片常 规脱 蜡 至 水 ， 酶修 复 液修 复 抗 原 ， 胰 滴加 相 应 一抗 ［ 阴性 对 照
１ 材料 ： Ｇ 免疫组织化学检测试剂盒 （ ． １ ＮＦ 武汉博
亲和素 ，７℃，０ｒｎ 二 氨基 联苯胺 （ Ａ ） 色 ， ３ ４ ｉ。 ａ Ｄ Ｂ显 至 阳性细 胞与 阴性组 织有 明显 反差 ，双 蒸水 水洗 终止 反应 。苏木素 染液 复染 ５Ｓ双蒸 水浸洗 ２ｍｎ ， ｉ。酒精 梯度 脱水 ， 甲苯 透 明 ， 二 中性 树 胶 封 片 ， 微 镜下 观 显
新 西兰大 白兔 ２ ４只， 切断双侧坐骨神经 ， 分为 ４ ， 组 每组 ６只。Ｉ 组为第 ５ 天进行神经修复组 ． Ⅱ组
为第 ｌ ５天神经修复组 ， Ⅲ组为第 ２ ５天神经修复组 ， Ⅳ组为即时神经修复组。修复后 １ ， 周 各组随机抽取 ３只． 取 修复神经段 的远端 ， 进行神经生长因子（ Ｇ ） Ｎ Ｆ 免疫组织化学检测 ， 并进行灰度值分析 ； 修复后 ２个月各组进行苏 木素一 伊红（ Ｅ） Ｈ 染色 、 透射 电镜及轴突计 数等检测 。结果 计学意义（ ｌ ．５ 。结论 Ｊ ００ ） Ｐ ＜ 即时修复组与第 ５天神经修 复组 Ｎ Ｆ含量分别高于 Ｇ 其他 ２组 （＜ ． ）这 ２组间进行比较差异无统计学意义 ， ２ 尸Ｏ ５， ０ 第 ５天神经修复组含量最低 ， 与其他组 比较差异有统 ５ｄ内修复受损神经 的局部 Ｎ Ｆ含量最高， Ｇ 其修 复效果最佳。
微镜 下观察 。 １ 透 射 电镜 检查 ： 各 组 缝 合 神 经 段 ， 戊 二 醛 ． ５ 取 经
溶 液 固定 ， 制成 电镜超 薄切 片 ， 透射 电镜 下 观察髓 鞘 及轴 突 的再 生 情况 、 层结 构是 否整 齐 、 旺细胞 再 板 许
生 情况 。
１ 轴 突计 数 ： ． ６ 光镜 切 片 （ 修复 神经 段 远端 ）４ ０ 取 ，０ 倍 显 微镜 下 ， 用 Ｉ ａｅ Ｐｏ图文 分析 系统 ， 应 ｍ ｇ— ｒ 计数 １ ｍｍ １ｍ ｘ ｍ横 断面 的轴突数 。 １ 石蜡 切 片 图像 分析 ： 疫 组织 化 学 的石蜡 切 片 ． ７ 免
生垦垫塑与临床２ １ 年 ９ ０１ 月第 ｌ 卷第 ９ Ｃ ｉ ｓ Ｒｍ ｄ ｓ ｌ ｉ １ 期 ｈ ｅ ｅ ｅｉ ＆Ｃｉｃ ｎｅ ｅ ｎｓ
不 同时 间修 复周 围神 经 损伤 后 神经生长 因子含量 的变化
黄 国顺 李 璐 姚旭风 邢 建民
【 摘
效果 。 方法
要 】 目的 观察在不同时期修复受损兔坐骨神经后 ， 其局部神经生长因子 （ Ｇ ） Ｎ Ｆ含量的变化及修复
ｔｅｆ ｒ ｒｕ ｓ ｅｅｓ ｄｅ ｉ ＨＥｓ ｉｉｇ ｔ ｎｍ ｓ ｏ ｌ ｔ ｎｍｉ ｏｃｐ ｒ Ｍ１ ｎ ｘｎｃｕ ｔ Ｒｅｕｔ Ｔ ｅ ｈ ｕ ｏｐ ｒ ｔ ｉ ｗ山 ｏ ｇ ｗ ｕ ｄ ａ ｎ ．ｒ ｓ ｉ ｉｎｅｅ ｒ ｃ ｓｏ ｅ（Ｅ ｄａｏ ｏ ｎｓ ｓｌ ｈ ｔｎ ａ ｓ ｃｏ ｒ ａ ． ｓ ｌｖｌ ｏ Ｎ Ｆｉ ｇ ｕｓ１ ｎ １ ｅｅｈｇｅ ａ ｏｅｉ ｔｅ ｔ ｒ ｒｕ ｓｆ＜ ． ） ｂｔ ｅｅｎ ｔ ｉ ｉｃｎ ｙｄ － ｅｅ ｆ Ｇ ｏ ｐ ａｄ ｗ ｒ ｉｈｒ ｈｎｔ ｓ ｈ ｏｐ Ｏ ５， ｕ ｗ ｒ ｏ ｓ ｎｆ ａｔ ｉ ｓ ｎｒ Ｖ ｔ ｈ ｎｈ ｏ ｅｇ Ｐ ０ ｇ ｉ ｌ ｆ ｆｒｎ ｂ ｔｅｎｇｏｐ ｎ ｅｅｔ ｅ ｅ ｕ ｓ Ｖ ａｄ Ｉ． Ｇ ｏｐ１ ａ ｅ ｏ ｅｔｅｅ ｏ Ｇ ｓ ｏ ａｅ ｉ ｅ ｔｅ ｒｕ ｓ Ｐ ００ ） ｗ ｒ ｌ ｒｕ １ｈｄｔ ｗ ｓ ｌ ｌ ｆ Ｆａ ｍｐｒｄｗｔ ｔ ｈｒ ｏ ｐ ｆ＜ ． ． ｈｌ ｖ Ｎ ｃ ｈｈ ｏ ｇ ５
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低直接影响到受损神经的修复效果。本实验在不同 时间段修复受损坐骨神经后 ， 进行 Ｎ Ｆ免疫组织化 Ｇ 学检测 、 苏木素一 伊红（ Ｅ 染色、 Ｈ） 透射电镜检查及轴 突计 数 ， 检测不 同时间段 修复 受损 坐 骨神 经后 ， 复 修
段 Ｎ Ｆ含 量变 化 ， 比较 不 同时间段 的修 复效果 。 Ｇ 并
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１ 苏 木 素一 红 （ Ｅ） 色 ： 蜡 切 片 常规 脱蜡 至 ． ４ 伊 Ｈ 染 石 蒸馏 水 。苏木 素 染液 染 色 ５ｒｉ，盐 酸酒 精 中分 化 ｎ ａ ３ 。 氨 水返 蓝 ３ ， 片浸 入 伊 红 染液 内复 染 ４ ０Ｓ稀 ０ｓ切 ｍｎ 梯度 酒 精脱 水 ， 甲苯 透 明 ， ｉ， 二 中性 树 胶 封 片 ， 显
各 ５ ．在显微镜下观察 ，经图像采集仪输入计算 例 机， 每个 样 本 随 机 选 取 ５个 视 野 ， Ｉ Ａ一 ００图 用 ＭＳ ２０ 像处理软件提取各视野表达信号的灰度值 ，并计算 其平 均灰 度值 （ 灰度值 越高 ， Ｇ Ｎ Ｆ含 量越 高 ） 。 １ 统 计学方 法 ： 有计 量资 料采用 互 ｓ ． ８ 所 ± 表示 ， 免疫
中国药物 与临床 ２ １ 年 ９月第 １ 卷第 ９ Ｃ ｉ ｓ Ｒ ｍ ｄ ｓ Ｃｉｃ，ｅｔ ｂｒ ０ ｌ ！ ： ０１ １ 期 ｈｎ ｅ ｅ ｅｉ ＆ ｌｉ Ｓｐ ｍ ｅ ２ １ｏ ｅ ｅ ｎｓ ｅ ：
察。
好 ，轴突 变性 程度轻 ； Ⅱ组 神经 纤维 结 构破 坏不 明 显 ， 列 略紊 乱 ， 经 纤 维 束膜 水 肿 明显 ， 围可 见 排 神 周 淋 巴细胞浸 润 ， 鞘 轴 突变性 轻 ； 髓 Ⅲ组 可 见较 多神 经 纤维 结构破 坏 ， 排列 略紊 乱 ， 神经 束膜 周 围可 见大 量
【 ｙｗｏｄ 】 Ｐ ｒ ｈｒｌ ｅ ｅ ； Ｗｏ ｎｓ ｎ ｊｒ ｓ ｅ ｅ ｒｗｈｆｃ ｒ ｅａｒ Ｋｅ ｒ ｓ ｅｉ ｅａ ｎｒ ｓ ｐ ｖ ｕ ｄ ｄｉ ｕｉ ；Ｎ ｒ ｏ ｔ ｔ ；Ｒ ｐｉ ａ ｎ ｅ ｖ ｇ ａｏ
周 围神经 损伤 后能 否成 功再 生 ，主要 取决 于是 否 具有适 合离 断神 经生 长再 连接 的微 环境 条件 和 中 枢 神经元 活力 。而 神经 生长 因子 （ Ｇ ） 构成 良 Ｎ Ｆ是 好 微环境 的重 要 因素 ，在神 经损 伤后 具有 保护 神经 元 、 进轴 突 再生 的作 用 ＿ 。其在 微环 境 中含 量 高 促 ３ １
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【 关键词 】 周 围神经 ；创伤和损伤 ； 神经生长 因子 ；修复
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１ 材料 ： Ｇ 免疫组织化学检测试剂盒 （ ． １ ＮＦ 武汉博
亲和素 ，７℃，０ｒｎ 二 氨基 联苯胺 （ Ａ ） 色 ， ３ ４ ｉ。 ａ Ｄ Ｂ显 至 阳性细 胞与 阴性组 织有 明显 反差 ，双 蒸水 水洗 终止 反应 。苏木素 染液 复染 ５Ｓ双蒸 水浸洗 ２ｍｎ ， ｉ。酒精 梯度 脱水 ， 甲苯 透 明 ， 二 中性 树 胶 封 片 ， 微 镜下 观 显
新 西兰大 白兔 ２ ４只， 切断双侧坐骨神经 ， 分为 ４ ， 组 每组 ６只。Ｉ 组为第 ５ 天进行神经修复组 ． Ⅱ组
为第 ｌ ５天神经修复组 ， Ⅲ组为第 ２ ５天神经修复组 ， Ⅳ组为即时神经修复组。修复后 １ ， 周 各组随机抽取 ３只． 取 修复神经段 的远端 ， 进行神经生长因子（ Ｇ ） Ｎ Ｆ 免疫组织化学检测 ， 并进行灰度值分析 ； 修复后 ２个月各组进行苏 木素一 伊红（ Ｅ） Ｈ 染色 、 透射 电镜及轴突计 数等检测 。结果 计学意义（ ｌ ．５ 。结论 Ｊ ００ ） Ｐ ＜ 即时修复组与第 ５天神经修 复组 Ｎ Ｆ含量分别高于 Ｇ 其他 ２组 （＜ ． ）这 ２组间进行比较差异无统计学意义 ， ２ 尸Ｏ ５， ０ 第 ５天神经修复组含量最低 ， 与其他组 比较差异有统 ５ｄ内修复受损神经 的局部 Ｎ Ｆ含量最高， Ｇ 其修 复效果最佳。
微镜 下观察 。 １ 透 射 电镜 检查 ： 各 组 缝 合 神 经 段 ， 戊 二 醛 ． ５ 取 经
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生 情况 。
１ 轴 突计 数 ： ． ６ 光镜 切 片 （ 修复 神经 段 远端 ）４ ０ 取 ，０ 倍 显 微镜 下 ， 用 Ｉ ａｅ Ｐｏ图文 分析 系统 ， 应 ｍ ｇ— ｒ 计数 １ ｍｍ １ｍ ｘ ｍ横 断面 的轴突数 。 １ 石蜡 切 片 图像 分析 ： 疫 组织 化 学 的石蜡 切 片 ． ７ 免
生垦垫塑与临床２ １ 年 ９ ０１ 月第 ｌ 卷第 ９ Ｃ ｉ ｓ Ｒｍ ｄ ｓ ｌ ｉ １ 期 ｈ ｅ ｅ ｅｉ ＆Ｃｉｃ ｎｅ ｅ ｎｓ
不 同时 间修 复周 围神 经 损伤 后 神经生长 因子含量 的变化
黄 国顺 李 璐 姚旭风 邢 建民
【 摘
效果 。 方法
要 】 目的 观察在不同时期修复受损兔坐骨神经后 ， 其局部神经生长因子 （ Ｇ ） Ｎ Ｆ含量的变化及修复
ｔｅｆ ｒ ｒｕ ｓ ｅｅｓ ｄｅ ｉ ＨＥｓ ｉｉｇ ｔ ｎｍ ｓ ｏ ｌ ｔ ｎｍｉ ｏｃｐ ｒ Ｍ１ ｎ ｘｎｃｕ ｔ Ｒｅｕｔ Ｔ ｅ ｈ ｕ ｏｐ ｒ ｔ ｉ ｗ山 ｏ ｇ ｗ ｕ ｄ ａ ｎ ．ｒ ｓ ｉ ｉｎｅｅ ｒ ｃ ｓｏ ｅ（Ｅ ｄａｏ ｏ ｎｓ ｓｌ ｈ ｔｎ ａ ｓ ｃｏ ｒ ａ ． ｓ ｌｖｌ ｏ Ｎ Ｆｉ ｇ ｕｓ１ ｎ １ ｅｅｈｇｅ ａ ｏｅｉ ｔｅ ｔ ｒ ｒｕ ｓｆ＜ ． ） ｂｔ ｅｅｎ ｔ ｉ ｉｃｎ ｙｄ － ｅｅ ｆ Ｇ ｏ ｐ ａｄ ｗ ｒ ｉｈｒ ｈｎｔ ｓ ｈ ｏｐ Ｏ ５， ｕ ｗ ｒ ｏ ｓ ｎｆ ａｔ ｉ ｓ ｎｒ Ｖ ｔ ｈ ｎｈ ｏ ｅｇ Ｐ ０ ｇ ｉ ｌ ｆ ｆｒｎ ｂ ｔｅｎｇｏｐ ｎ ｅｅｔ ｅ ｅ ｕ ｓ Ｖ ａｄ Ｉ． Ｇ ｏｐ１ ａ ｅ ｏ ｅｔｅｅ ｏ Ｇ ｓ ｏ ａｅ ｉ ｅ ｔｅ ｒｕ ｓ Ｐ ００ ） ｗ ｒ ｌ ｒｕ １ｈｄｔ ｗ ｓ ｌ ｌ ｆ Ｆａ ｍｐｒｄｗｔ ｔ ｈｒ ｏ ｐ ｆ＜ ． ． ｈｌ ｖ Ｎ ｃ ｈｈ ｏ ｇ ５
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低直接影响到受损神经的修复效果。本实验在不同 时间段修复受损坐骨神经后 ， 进行 Ｎ Ｆ免疫组织化 Ｇ 学检测 、 苏木素一 伊红（ Ｅ 染色、 Ｈ） 透射电镜检查及轴 突计 数 ， 检测不 同时间段 修复 受损 坐 骨神 经后 ， 复 修
段 Ｎ Ｆ含 量变 化 ， 比较 不 同时间段 的修 复效果 。 Ｇ 并
ｔｅ ｅ ｒ ｉｅ ｒ Ｇ ｖ ｌ ｙｉ ｍ ｎ ｈｓ ｃ ｅ ｉ ｒ ｎ ｕ ｊ ｔ ｒ ａｕ ｎ ｌｓ ． Ａ ｎ ｓ ｔ ｐ ｉ ｈ ｎ ｄ ｔ ｎ Ｆ ｌ ｅ ｂ ｕ ｏ ｉ ｏ ｈ ｍ ｓ ｙａ ｄ ｓ ｂｅ ｅ ｔ ｇ ｙｖ ｌｅａ ａｙｉ ｅ ｍ ｏ ｆ Ｎ ｅ ｍ ｔ ｔ ｃｄｏ ａ ｓ ｔ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ａ ， ２ ｈ ａ ｒｅ ｒ ｆ