第三章 基因工程常用的克隆载体

提取纯化质粒DNA： 氯化铯-溴乙锭密度梯度离心 法（CsCl-EtBr）
质粒DNA纯度高、周期长、 设备要求高、存在溴乙锭污 染！
变性特性
cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条 件即可复性。
提取纯化质粒DNA： 微量碱变性法
裂解菌体细胞 加NaAc调pH至4.8 加碱调pH至12～12.5 离心 去除蛋白质、RNA DNA变性
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18 来源：大肠杆菌 Ori： 标记基因：apr、lacZ’ MCS： 分子大小：2686bp 拷贝数：1000-2000/cell
第二节 λ噬菌体载体
λ 噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 λ DNA缺失达总量20%的DNA时，仍不影响其特性，可为外源 基因提供装载空间
质粒DNA纯度较低、周期较短！
复制特性
拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分 子的数目 • 严紧型复制：1-2个 • 松弛型复制：10-100个
制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑 制剂，增加质粒拷贝数！
三、质粒载体应具备的条件
具有复制起始位点 具有至少两种易被检测的选择性标记 具有多克隆位点（MCS）
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
cΙ 基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活
cΙ 基因表达：溶源途径 cΙ 基因不表达：溶菌途径 形成浑浊噬菌斑 形成噬菌斑
四、 λ噬菌体载体的构建
消除多余的限制性内切酶位点 点突变 基因组置换、缺失 增加单一酶切位点 去除非必要区段 λ 噬菌体头部蛋白可包装DNA大小：75～105% λ DNA长度 （38～52kb） 增加筛选标记基因
质粒DNA编码的表型
抗性特性 抗生素抗性： • Ampr
• • • • Cmlr Kanr Strr Tetr
重金属抗性： Hg、Ni、Co、Pd、Zn 毒性阴离子： 砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐 其他： 嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体
代谢特性： 冠瘿碱代谢 修饰寄主生活方式： 植物冠瘿病、发根病
第三章 基因工程常用的克隆载体
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
第一节 质粒载体
一、质粒的定义
存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主 复制的遗传成分（复制子）
复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位 染色体DNA 质粒DNA 噬菌体DNA
一、基本概念
噬菌体感染周期：
E.coli
裂解
吸附 注入 复制
包装
溶菌途径 溶源途径
烈性噬菌体 温和噬菌体 原噬菌体 营养体 溶源菌
整合
二、 λ噬菌体的形态结构及繁殖特性
形态结构
头部：正二十面体、 直径约55nm λ DNA：线性、约48kb
尾部：长约150nm、粗 12nm
繁殖特性
λ 噬菌体
五、 λ噬菌体载体的主要类型
插入型载体： λ DNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源 DNA插入的酶切位点
特点：承载能力较小（<10kb） 筛选标记：基因插入失活
免疫功能失活的插入型载体 β -半乳糖苷酶基因失活的插入型载体
免疫功能失活的插入型载体
Hale Waihona Puke Baidu表达阻遏蛋白 CΙ 基因
插入片段 CΙ 基因
侵染
E.coli
溶源菌
裂解
浑浊噬菌斑
三、 λDNA的结构及功能
COS 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS 5’ TCCAGCGGCGGGG
溶菌控制基因
cos
R
A
头部合成基因
晚期控制基因
DNA合成控制基因 阻遏基因(cΙ 、cⅡ) 早期控制基因
N
l - DNA
尾部合成基因
J 左臂区：A→J 中间区：J →N 右臂区：N →R
标记基因：apr、tcr
分子大小：4363bp 拷贝数：50-100/cell
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI ROP Origin of Replication Hind II Bal I
EcoRI
SstI
KpnI
SmaI BamHI XbaI
SalI
PstI
SphI
HindIII
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
二、质粒DNA分子的特性
结构特性
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA，covalently closed circular DNA ） OC型 开环DNA（ocDNA，open circular DNA ） L 型 线性DNA（L-DNA，line DNA）
染料结合特性：
呈平面结构的染料（EB）可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA 由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比L-DNA少，因此密度 较大。
多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一 识别序列所组成的DNA序列
具有尽可能小的相对分子质量
易于分离纯化 目的DNA装载能力强 拷贝数高 多重酶识别位点几率低
应属于松弛型复制 应为非传递型
四、几种常用的质粒载体
pBR322 来源：大肠杆菌 Ori： EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Pvu I Pst I Apr Tcr
不表达阻遏蛋白
体外包装
β -半乳糖苷酶失活的插入型载体
表达酶
蓝色混浊噬菌斑
LacZ基因
插入片段
LacZ基因
不表达酶
无色混浊噬菌斑
替换型载体： 又称取代型载体。在λ DNA可替换片断两端具有两个限制 酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNA片断取 代
特点：承载能力大 筛选标记： λ DNA大小 β -半乳糖苷酶基因替换
六、 l-DNA作为载体的优点
λ DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 λ DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组λ DNA分子的筛选较为方便
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