菌种的衰退、复壮和保藏

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同
的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种
方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具
体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏
物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一
些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各
种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而
肠道中的正常菌群，大肠杆菌，一旦进入泌尿系统，引起尿路感染。 人体表面的正常菌群，一旦它们进入伤口也会引起感染。 条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常聚居部位， 或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。
可通过口服某些活的微生物制剂 来治疗由于正常菌群失调而导致的腹泻。 •含蜡状芽孢杆菌（B.cereus）的“促菌生”， •含地衣芽孢杆菌的“整肠生”、 •枯草芽孢杆菌和肠球菌的“妈咪爱”、
五、 工农业产品上的微生物
1. 工业产品
大量工业制品都是直接或间接用动植物作原料来制造的 纤维制品、木制品、革制品、橡胶制品、油漆、卷烟、化妆品等 有些工业产品如塑料、建筑涂料等也有很多微生物可以分解、利用
光学仪器上的镜头，建筑泥浆、钢缆、地下管道、金属材料等，
各种电讯器材、文物、书画等也可被多种特殊微生物所破坏。
第九章 微生物的生态
生态学：
研究生物及其环境条件间相互作用规律的科学 。 根据生态学的研究对象和采用的研究方法不同, 生态学的 分类不同。
微生物生态学：
在一定意义上也可以称为环境微生物学，是研究微生物 群体与其环境系统之间相互作用及其功能表达规律的科学 。
微生物生态学研究的主要三个目的： ①阐明自然界中微生物的生物多样性和微生物群落中不 同群体之间相互作用的关系； ②测定自然界中微生物的活动并监测它们对生态系统的 影响； ③充分挖掘特殊生态环境中有益微生物，使其更好地为 人类服务。
肉毒毒素、
黄曲霉素等
有利影响：
利用特定的微生物制备风味食品，如酱制品、米酒、腌酸菜等；
可采用多种方法防止微生物对食品等的破坏
五、 极端环境下的微生物
嗜热微生物(thermophilles)
嗜冷微生物(psychrophiles)
嗜酸微生物(acidophiles)
嗜碱微生物(alkslinophiles)
上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染 并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。
“水花”或“水华”（water bloom）：
藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体(淡水水体)出现颜色， 并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。
赤潮或红潮（red tides）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。
第八节 菌种的衰退、复壮和保藏
性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本 要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异； b）污染；
c）死亡.
一、菌种的衰退(degenration)
1. 衰退的表现
1）原有形态形状变得不典型； 2）生长速度变慢； 3）代谢产物生产能力下降； 4）致病菌对宿主侵袭力下降； 5）对外界不良环境的抵抗力下降。
嗜盐微生物(halophile)
嗜压微生物(barophiles)
微生物在各类工业产品上的生长所造成的产品 的霉腐给人类造成了巨大的损失! 而另一方面，也想开发并推广使用可被微生物 降解的产品，或利用微生物的降解特性。
---------生物可降解塑料 ---------开发、利用纤维素（能源、饲料）
---------苎麻脱胶
2. 食品、农副产品
不利影响： 由于微生物的生长繁殖而腐烂、变质，不能再食用或使用； 病原微生物进入人体的重要途径，引起传染性疾病； 很多微生物在食品、农产品上生长后会产生对人有害的毒素；
（ American Type Culture Collection ，美国典型菌种保藏中 心）
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法：
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism，中国微生物菌种保藏委员会）
斜面传代法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法
导致菌种的丧失。
本章重点
一、了解证明核酸是遗传变异物质基础的3个经典实验 比较：基因型与表型，变异与饰变 质粒的概念，特点及主要类型。
二、基因突变和诱变育种 1. 基因突变的类型 2. 基因突变的规律 3. 了解常用诱变剂及其诱变机制 4. 艾姆氏法检测致癌剂的理论依据、方法和优点
5. 了解诱变育种的主要环节及常用的初筛方法； 掌握UV诱变育种的操作程序及注意事项。 6. 筛选营养缺陷型突变株的主要步骤和方法， 淘汰野生型的方法 7. 抗生素高产突变株及抗性突变株的筛选方法。
微生物生态系统： 微生物与其周围的环境（包括动植物）组成的具有一定 结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中，微生物之 间、微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 相互依存构成一个稳定的系统关系 。
本章内容
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 自然界中的微生物 微生物生态学的研究方法 微生物活性的测定方法 微生物在自然界物质循环中的作用 微生物之间的关系 微生物与环境治理 瘤胃微生物生态系统 产甲烷作用和互养共栖
第一节
自然界中的微生物
一、 土壤中的微生物
土壤是微生物生长繁殖的天然培养基 ，是人类最丰富的
“菌种资源库”。
不同类型的土壤、同一类型土壤的不同深度或不同水平 位置，微生物种类和数量变化很大。
由于表土层土壤比较干燥，且接受大量紫外线照射，所 以微生物主要分布在营养条件良好、氧气含量比较丰富的浅 土层
2. E. coli F+、F-、Hfr和F’菌株的异同及相互间关系。 3. 原生质体融合的基本操作及优点。 4. 酿酒酵母有性杂交的育种程序。
四、基因工程 名词，基本操作 五、菌种的衰退、复壮与保藏 1. 菌种衰退的表现、原因与防止措施。 2. 菌种保藏的原理与常用的保藏方法。ATCC 和 CCCCM采用的菌种保藏法。
2. 衰退的原因
1）根本原因在于基因自发突变； 2）传代次数的影响，使负突变株的比例逐渐占 了优势； 3）与培养条件有关。
衰退是发生在微生物细胞群体中的一 个由量变到质变的逐步演变的过程。
二、衰退的防止与复壮
（一）防止衰退的措施
1. 减少传代次数； 2. 创造良好的培养条件；
p228
3. 利用不易衰退的细胞传代
水体的污染——富营养化和“水花”、“赤潮”
水体大量的有机物或无机物，特别是磷酸盐和无机氮化合物
水的富营养化
藻类等过量生长，产生大量的有机物
异养微生物氧化这些有机物，耗尽水中的氧， 使厌氧菌开始大量生长和代谢 分解含硫化合物，产生H2S，从而导致水有难闻的气味， 鱼和好氧微生物大量死亡，水体出现大量沉淀物和异常颜色
干燥
沙土管、冷冻真空干燥
1. 原理
人为地创造有利于微生物长期休眠的条件，主要是 低温、干燥、缺氧。
2. 保藏方法
7种常用方法 (p244表7-13） （1）斜面冰箱保藏法 （2）半固体冰箱保藏法 （3）石蜡油封藏法 （4）甘油悬液保藏法 （5）沙土管保藏法 （6）冷冻干燥保藏法 （7）液氮保藏法
ATCC采用的菌种保藏法：
它们都是通过芽孢杆菌的生长，为肠道重新创造良好的厌氧
环境，促使肠道内正常的厌氧菌的生长繁殖。 含双歧杆菌和乳酸菌的“金三歧”、“培菲康”、“丽珠肠 乐” 是通过乳酸菌产生乳酸来降低肠道pH而抑制腐败菌的生长。 这类活的微生物制剂又称为微生态制剂
微生态制剂一般用于恢复肠道内的正常生态环境， 若肠道功能正常，一般不需要服用！
4）耐高压（特别是生活在深海的细菌）。
三、 空气中的微生物
1）无原生的微生物区系； 2）来源于土壤、水体及人类的生产、生活活动；
3）种类主要为真菌和细菌，一般与其所在环境的微生物种类有关； 4）数量取决于所处的环境和尘埃数量； 5）停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关； 6）与人类的关系： 传播疾病； 造成食品等的污染；
饮用水的微生物指标： a）致病菌一般对营养要求苛刻，因此在一般的水中只能存活2~3天； 总菌数： < 100个/ml b）水表微生物会受辐射等作用而被杀灭； 大肠杆菌：< 3 个/L c）原生动物等的吞噬作用； d）由固形物吸附再沉积到水底；
在光线充足的沿岸带、湖水带分布着大量光 合藻类和好氧微生物（假单胞菌、嗜纤维菌、 柄细菌、生丝微菌等） 深水带，光线少、溶解氧低，可见紫色和绿 色硫细菌及其他兼性厌氧菌。 湖底区分布着大量厌氧微生物，主要有脱硫 弧菌、甲烷菌、梭菌等。
微生物学的基本技术：
无菌操作技术
四、 生物体内外的正常菌群 1. 人体的正常微生物区系
正常人体的皮肤、黏膜及肠道等部位，存在大量的、种类稳定 的微生物，称为人体正常菌群。
皮肤表面：微球菌、链球菌、葡萄球菌和霉菌； 肠道：大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌 （厌氧菌占绝大多数）
正常菌群与人体保持平衡状态，菌群内部的各种微生物之间 相互制约，相对稳定。
正常情况下，正常菌群与人体间是一种互生关系
正常菌群通过肠道获取营养；
正常菌群通过排阻、抑制外来致病菌； 能合成许多人体必需的维生素、氨基酸；
环境条件改变或着生部位改变：
正常菌群
Biblioteka Baidu致病菌
滥用抗生素； 人身体虚弱抵抗力下降； 吃了不洁净的食物；
2. 无菌动物与悉生动物
无菌动物：在其体内外不存在任何正常菌群的动物。 悉生生物：人为地接种上某种或某些已知纯种微生物 的无菌动物（或植物）。 用于科学研究：
干扰因素少，操作易控制，既可进行定性分析，也可进行定量分析， 实验结果准确、可靠，对于了解微生物与宿主之间复杂的关系及其 机理具有十分重要的作用。
每克耕作层土壤含菌量十倍递减
细菌（~108）
>放线菌（~107，孢子） >霉菌（~106，孢子） >酵母菌（~105） >藻类（~104）
>原生动物（~103）
二、水体中的微生物 1. 淡水微生物
1）数量和种类与接触的土壤有密切关系； 2）吸附于悬浮在水中的有机物上及水底； 3）多能运动，有些具有很异常的形态（例如柄细菌）； 4）靠近城市或城市下游水中的微生物多，并且有很多对健康 不利的细菌，因此不宜作为饮用水源； 5）水体自身存在自我净化作用： 水中的病原微生物会对水质产生重要影响
4. 采用有效的菌种保藏方法；
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种(狭义复壮，消极措施)。 a）纯种分离;
b）通过寄主体进行复壮； 2. 有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体(广义复壮，积极措施) 。
纯种的分离方法
平板划线分离法 平板涂布分离法 平板倾注分离法 用“分离小室”进行单细胞分离 显微操纵器进行单细胞分离 菌丝尖端切割法进行单细胞分离
菌落纯
细胞纯
三、菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
培养基传代培养 生活态 寄主传代培养 冷冻
液氮、低温冰箱 斜面、平板
基本方法：
休眠态
8. 名词：
营养缺陷型，野生型，原养型，基本培养基， 完全培养基，补充培养基，点突变，转换， 颠换，移码突变，染色体畸变，光复活作用
三、基因重组与杂交育种 1. 了解原核生物和真核微生物基因重组的方式。 名词概念： 转化，转染，转导，普遍转导，局限转导， 低频转导，高频转导，双重溶源菌，接合，性导， Hfr菌株， 溶源转变。 比较： 转化与转染，转导与性导，转导与溶源转变， 普遍转导与局限转导，LFT与HFT 有性生殖与准性生殖， 转化、转导、接合和原生质体融合
引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气危害养殖 业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡，
因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用
危严 害重 人污 类染 健的 康水 会 通 过 食 物 链 的 生 物 放 大 作 用
2. 海水微生物
1）嗜盐，真正的海洋细菌在缺少氯化钠的情况下是不能生长的； 2）低温生长，除了在热带海水表面外，在其它海水中发现的 细菌多为嗜冷菌； 3）大多数海洋细菌为革兰氏阴性细菌，并具有运动能力；