亲和层析原理和步骤
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体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
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2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
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（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
亲和层析 Affinity Chromatography
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1
一、原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术
➢ 寻找配基 ➢ 配基固定化 ➢ 制成亲和层析柱
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2
基本过程 •固相化
+
a
3
吸附
+
+ 洗 脱
a
4
解吸
+
a
5
载体
a
6
固相化 再生
样品
a
7
Hale Waihona Puke Baidu a
8
a
9
常见具有专一性亲和力的生物分子对：
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
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（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
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（二）配基的选择
1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团
酶： 抗体： 细胞： 核酸： 激素或药物： 外源凝集素：
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
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（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
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以酶和底物为例：
KL：解离常数 E： 酶
E+L
KL
EL
L： 底物 EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]
E0、L0：起始浓度
当L0》E0时
KL =[E0-EL][L0]/[EL]
[EL]=[E0-EL][L0]/ KL
Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 （3）专一性洗脱
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4、亲和柱的再生：
已使用过和柱，经过再生处理，去除 非特异吸附的杂质后，可重复使用
再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处理 用弱酸或弱碱溶液处理
a
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三、特点
1、一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、可去除已变性或部分降解物质
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四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
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载体
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实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
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（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基
质上制成固相化吸附剂
载体的排斥效应 载体的空间障碍
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二、亲和层析分离
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高
有效吸附
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洗脱方法
（1）非特异性洗脱：改变
洗脱液pH值
离子强度
梯度洗脱
（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱 会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体 的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。
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2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
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（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
亲和层析 Affinity Chromatography
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一、原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术
➢ 寻找配基 ➢ 配基固定化 ➢ 制成亲和层析柱
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基本过程 •固相化
+
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吸附
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+ 洗 脱
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解吸
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载体
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固相化 再生
样品
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常见具有专一性亲和力的生物分子对：
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
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（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
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（二）配基的选择
1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团
酶： 抗体： 细胞： 核酸： 激素或药物： 外源凝集素：
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
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（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
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以酶和底物为例：
KL：解离常数 E： 酶
E+L
KL
EL
L： 底物 EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]
E0、L0：起始浓度
当L0》E0时
KL =[E0-EL][L0]/[EL]
[EL]=[E0-EL][L0]/ KL
Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 （3）专一性洗脱
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4、亲和柱的再生：
已使用过和柱，经过再生处理，去除 非特异吸附的杂质后，可重复使用
再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处理 用弱酸或弱碱溶液处理
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三、特点
1、一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、可去除已变性或部分降解物质
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四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
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实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
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（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基
质上制成固相化吸附剂
载体的排斥效应 载体的空间障碍
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二、亲和层析分离
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高
有效吸附
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洗脱方法
（1）非特异性洗脱：改变
洗脱液pH值
离子强度
梯度洗脱
（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱 会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体 的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。