烟草愈伤组织诱导与植株再生

烟草愈伤组织诱导与植株再生

摘要：烟草( Nicotiana tabacum L. )又名草烟，为茄科烟草属的一年生草本植物，是重要的经济作物，常被作为基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物[1-5]，具有药用、工业用、保健和美容等多种价值。近年来有人从花烟草中提取出NaD1,具有抗肿瘤的功效[6]。利用愈伤组织诱导与植株再生的细胞工程技术来培育烟草可以大大节约烟草的培育成本。本实验以烟草叶片为实验材料，分别在黑暗、16h/d光周期条件下，用MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L 培养基诱导烟草叶片形成愈伤组织。用MS+BA 2mg/L + NAA 0.5mg/L培养基全光照诱导分化。实验结果

关键词：烟草；愈伤组织；诱导分化；植株再生；光周期

Callus induction and plant regeneration of Nicotiana tabacum L

Shi Meng-wei

(Biotechnology Class 1403)

Abstract: Nicotiana tabacum L, also named herbal tobacco, which is classified in Solanaceae Nicotiana L plants, is an annual,as the important Model plant of Genetic engineering and Molecular biology. Tobacco possesses great value in medical, industrial, as well as in cosmetic area. In recent years,NaD1 which has the effect of anti-tumor has been extracted from Nicotiana alata. It is able to save the cost savings of cultivating tobacco by means of callus induction and plant regeneration. In this experiment, the leaves of tobacco are induced the formation of callus in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L under the light conditions of completely dark and 16h/d photoperiod, then induced redifferentiation in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L.

1前言

植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。进入新世纪以来，植物组织培养以植物生理学为基础发展起来。试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育等研究成果已经处在应用、推广阶段。离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物激素在调节细胞脱分化和再分化过程中起到主要作用。

烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一,在植物组织培养中占据着重要的地位, 同时它还具有较高的经济价值，烟草所含的烟碱等生物碱是重要的医药与化工原料。烟草是研究细胞脱分化和再分化的理想材料。很多学者对烟草进行了不同层次和水平上的研究, 获得了大量的植物组织培养研究的资料。本试验通过对烟草叶片进行了愈伤组织的诱导和分化培养,来研究烟草愈伤组织的生长发育情况和分化情况，进而为烟草的培养改良提供一些基础性支持。

2材料与方法

2.1实验材料

烟草无菌苗，由华中农业大学生物实验教学中心提供

2.2实验方法

2.2.1培养基配置

MS分化培养基配方：

表1 MS分化培养基配方

母液1L培养基加入量

大量元素50ml

微量元素5ml

铁盐5ml

肌醇5ml

维生素5ml

甘氨酸5ml

BA 0.8ml/L

NAA 0.2ml/L

像1L容器中加入大约700ml蒸馏水，按照表中的顺序以及量，向蒸馏水中加入以上成分。加入10g白砂糖，在室温下搅拌溶解。溶解完成后利用0.5N的NaOH 和 0.5N 的 HCl 调整 PH 至5.8-6.0。调好Ph后加入7g琼脂粉，置于电磁炉上加热搅拌溶解，沸腾后停止加热。利用蒸馏水定容到1L，搅拌混匀。分装入50ml小三角瓶中，并做好标记，高压蒸汽灭菌，每瓶20ml左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

MS诱导培养基配方：

表2 MS诱导培养基配方

母液1L培养基加入量

大量元素50ml

微量元素5ml

铁盐5ml

肌醇5ml

维生素5ml

甘氨酸5ml

BA 0.2ml/L

NAA 0.2ml/L

配制方法与分化培养基相同

2.2.2烟草叶片愈伤组织诱导培养

2.2.2.1烟草叶片接种

开始前30min。用75%乙醇将超净工作台擦洗干净，将无菌操作所需要的用品用75%酒精擦洗后置于超净工作台上。烟草无菌苗等也置于工作台中。将不锈钢镊子、剪刀、解剖刀置于75%酒精中打开超净工作台紫外灯。穿好工作服，在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。打开风机，关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成5mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种5小片。快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。