微生物实验指导全解

实验一微生物培养基的配制和灭菌

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件：(1)适当组分和比例的营养物质；(2)适宜的pH值；(3)合适的渗透压；(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物工作者的主要技术操作之一。

一、实验目的与耍求：

1．了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2．了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3．熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。

二、实验原理与材料：

(一) 培养基的种类

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：不加凝固剂。

固体培养基：在液体培养基中加2％左右的凝固剂。

半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％一0.5％凝固剂。

微生物最常用的凝固剂为琼脂(其次为明胶)，又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96℃以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。

表3-1 琼脂与明胶特性比较

（二）实验材料

1．药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂；马铃薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、

KN03，MgS04·7H20、FeSO4·7H20、等。

2．高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌。

3．其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。

三、实验方法与步骤：

(一)、培养基的配置

1．培养基的配制常用方法和步骤：

(1)称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。

(2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根据实验需要加入蒸馏水或自来水)，用玻棒搅匀，加热溶解。

(3)调pH值(调pH也可以在加琼脂后再调)，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。

(4)加琼脂熔化，在琼脂熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。

(5)分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装量为管高的五分之一。

特别注意不要使培养基粘污在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。

(6)包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆，挂上所配培养基名称的标签。

(7)灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面，(见图3一1)。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24小时，如确无菌生长，方可使用。

2．三种培养基的配方及配制

（1）.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(用于分离和培养细菌，是一种天然培养基)。

配方：牛肉膏 3克

蛋白胨 5克

氯化钠 3克

琼脂 20克

自来水 1000毫升

pH 7．2～7．4

灭菌 15磅／英寸2，30分钟。

本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨，30％氯化钠。以配制200毫升培养基为例：

吸取30％牛肉膏2毫升，50％蛋白胨2毫升，30％氯化钠2毫升，加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200毫升。用玻捧搅匀，在电炉上稍加热，调pH至7.4，加琼脂4克，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，(见图3—2)。装带有棉塞的无菌试管，装置五分之一的试管高度共12支，作斜面培养基。用铝壳试管帽的各装10毫升，约试管高度的二分之一以上，用作分离时倒平板用。

分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆，(图3—3)挂上标签，灭菌备用。

（2）．马铃薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)琼脂培养基。(用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基)。

配方：去皮马铃薯(或鲜豆芽) 200克

蔗糖(或葡萄糖) 20克

自来水 1000毫升

琼脂 20克

pH 自然

灭菌：(含蔗糖)15磅／英寸2 30分钟。

(含葡萄糖)10磅／英寸220分钟。

制备方法：配制200毫升培养基。

取去皮马铃薯40克，切成小块，放入无刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置电炉上加热，煮沸十分钟，用四层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200毫升，然后加蔗糖4克，加琼脂4克，加热熔化，并用玻棒不断搅拌，直至琼脂完全熔化，分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。

（3）淀粉琼脂培养基(高氏一号Gause’S1)，用于分离和培养放线菌之用，是一种合成培养基。

配方：可溶性淀粉 20.O克

KN03 1.0克

K2HP04 O.5克

MgS04·7H20 O.5克

NaCl O.5克

FeS04·7H20， O.01克

琼脂 20克

自来水 1000毫升

灭菌：15磅／英寸2，30分钟。

制备方法：配制200毫升培养基

吸取配方液：1％ KN03 20毫升；l％ K2HP04 lO毫升；l％ MgSO4·7H2O lO毫升；l％NaCl 10毫升；1％FeSO4·7H2O O.2毫升，加水补足至200毫升，置电炉上加热。用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4克，从200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后，将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，取下调pH至7.4，加琼脂4克，加热至琼脂完全熔化为止，趁热分装试管，下面一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。

（4）．无菌水的制备：

无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用的材料。

100毫升三角瓶(装有玻璃珠)，装自来水45毫升，试管中装9毫升自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。

(二)分离培养微生物常用器皿的准备

1．清洗一些玻璃仪器：如三角瓶，试管，培养皿、吸管等。

2．棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染。试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约l～2毫米处，用解剖针塞入少许棉花，(约1—1.5厘米长)，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花滑下为准。

教师示范做试管棉塞，同学每人做5支试管棉塞。棉塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉塞的长度约3厘米左右。塞入试管内部分约占2／3，头部稍大约占l/3左右，见图3—4。

1 2 3 4 5 .

图3-4 棉塞的要求条件

1.正确的式样

2.管内部太短，管外太松

3.管外太小

4.整个棉塞过松

5. 管内部太紧，管外太松

3．包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管，三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当(见示范)，每组同学包培养皿6只(一包)。

吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4～5厘米宽的长纸条的一端，约成45º角，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。见图3—5。