猪血清白蛋白的分离纯化与鉴定课件
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• 在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结
合力取决于彼此之间的静电吸引。
• 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子
浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的 蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。
• 本实验采用的DEAE－纤维素离子交换剂.
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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• 量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶
液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 ℃静置2 h；
• 4 ℃，13,000 rpm离心20 min，收集上清，
留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测 定蛋白质含量和电泳；
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• 用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液
的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积 （0.11×V）；
• 逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 ℃静置2 h；
• 4 ℃，１3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL
• 1 采血 • 2 血清分离 • 3 盐析法分离血清白蛋白 • 4 除盐
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• 收集血清：
取2 mL血液，4 ℃，3,000 rpm 离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.
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盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。
• 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因
此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会 重新溶解。
• 分级盐析实现蛋白质的分离纯化。 • 在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血
清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%， 白蛋白析出。
• 层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直
不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐 浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式 又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改 变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续 改变（连续洗脱）。
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• 除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵
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DEAE-纤维素离子交换层析：
1. 装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱
内，至8-10cm高度，平衡过夜；
2. 洗脱液流速调节为 1mL/min； 3. 上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待
样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进 入胶内；
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– 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总 量的60％。
– 它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多 种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持 血液的正常渗透压作用。
– 此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶 物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临 床及生物领域应用广泛 。
4. 洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.02～1.0mol／L醋
酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集；
5. 记录出现峰值的管号(样品4,…)
洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液）
五、血清白蛋白的相对分子质量测定 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 --SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小
（分子量）有关，如电荷、形状都一样， 则电泳迁移率只与分子量有关。
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• SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋
白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能 使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的 蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。
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原理与操作
血清的制备
白蛋白的分离
留样：2，3
留样：1
留样：4,…
白蛋白的纯化
白蛋白纯度的 检测
蛋白质含量的 白蛋白的相对分
测定
子质量的测定
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一、血清白蛋白的分离
缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维 素层析柱上，在此pH 时，DEAE -纤维素带有正电荷 ，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清 白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。α及β球蛋白等电 点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱 上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下 来。
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实验目的
1. 掌握血液样品的正确处理和制备方法 2. 掌握血清白蛋白粗分离的一般方法 3. 掌握离子交换法分离纯化蛋白质 4. 掌握蛋白质纯度检测的方法 5. 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
的原理和方法
6. 学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4 的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无 NH4＋存在；留0.1 ml（样3）至1.5 ml离心管，用于测 定蛋白质含量和电泳；
• NH4＋的检测：奈氏试剂
Baidu Nhomakorabea
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奈氏反应 奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无 机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐
砖红色的溶液或沉淀
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二、血清白蛋白的纯化
离子交换柱层析：
• 离子交换柱的安装 • 平衡 • 加样 • 洗脱 • 样品收集
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• 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子
浓度或pH来完成，对离子交换剂结合力最小的 蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。
• 本实验采用的DEAE－纤维素离子交换剂.
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• 量筒量取9 ml底液（50 %的饱和硫酸铵溶
液），用移液管逐滴加入，不断摇晃。4 ℃静置2 h；
• 4 ℃，13,000 rpm离心20 min，收集上清，
留0.5 ml（样2）至1.5 ml离心管，用于测 定蛋白质含量和电泳；
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• 用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，用量筒确定上清液
的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH4.5）的体积 （0.11×V）；
• 逐滴加入饱和硫酸铵（pH4.5），振荡，4 ℃静置2 h；
• 4 ℃，１3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 mL
• 1 采血 • 2 血清分离 • 3 盐析法分离血清白蛋白 • 4 除盐
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• 收集血清：
取2 mL血液，4 ℃，3,000 rpm 离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 mL至10 mL离心管；留0.1mL（样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳.
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盐析：中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。
• 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因
此，除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会 重新溶解。
• 分级盐析实现蛋白质的分离纯化。 • 在血清中加入硫酸铵，当饱和度为50%时，血
清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达55%， 白蛋白析出。
• 层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直
不变的方式洗脱，也可采用改变洗脱的盐 浓度和（或）pH的方式洗脱，后一种方式 又可以分为两种：一种是跳跃式的分段改 变（梯度洗脱），另一种是渐进式的连续 改变（连续洗脱）。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• 除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
DEAE-纤维素离子交换层析：
1. 装柱：将层析柱垂直固定。将DEAE-纤维素装入柱
内，至8-10cm高度，平衡过夜；
2. 洗脱液流速调节为 1mL/min； 3. 上样：将透析袋剪开，用移液管转至层析柱内，待
样品进入凝胶后再加入少量缓冲液，使样品完全进 入胶内；
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
– 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总 量的60％。
– 它是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多 种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持 血液的正常渗透压作用。
– 此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶 物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临 床及生物领域应用广泛 。
4. 洗脱：采用连续梯度洗脱，用0.02～1.0mol／L醋
酸－醋酸铵缓冲液（pH7.4）进行洗脱，收集；
5. 记录出现峰值的管号(样品4,…)
洗脱速度慢，可直接换B液（ 1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲液）
五、血清白蛋白的相对分子质量测定 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 --SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小
（分子量）有关，如电荷、形状都一样， 则电泳迁移率只与分子量有关。
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• SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋
白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能 使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的 蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。
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原理与操作
血清的制备
白蛋白的分离
留样：2，3
留样：1
留样：4,…
白蛋白的纯化
白蛋白纯度的 检测
蛋白质含量的 白蛋白的相对分
测定
子质量的测定
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一、血清白蛋白的分离
缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维 素层析柱上，在此pH 时，DEAE -纤维素带有正电荷 ，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清 白蛋白等电点为4 . 9 ，绝大多数。α及β球蛋白等电 点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱 上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下 来。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
实验目的
1. 掌握血液样品的正确处理和制备方法 2. 掌握血清白蛋白粗分离的一般方法 3. 掌握离子交换法分离纯化蛋白质 4. 掌握蛋白质纯度检测的方法 5. 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
的原理和方法
6. 学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
pH7.4的柠檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4 的柠檬酸缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无 NH4＋存在；留0.1 ml（样3）至1.5 ml离心管，用于测 定蛋白质含量和电泳；
• NH4＋的检测：奈氏试剂
Baidu Nhomakorabea
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
奈氏反应 奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无 机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐
砖红色的溶液或沉淀
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二、血清白蛋白的纯化
离子交换柱层析：
• 离子交换柱的安装 • 平衡 • 加样 • 洗脱 • 样品收集
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